Caracterización microbiológica de lodo residual

1. Resumen
3. Materiales y Métodos
4. Conteo de los microorganismos del Fango digerido
5. Aislamiento de las bacterias degradadoras de hidrocarburos
6. Resultados y Discusión
7. Conclusiones y Recomendaciones
8. Referencias

Resumen

En la búsqueda de aceleradores del proceso de biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos y residuos sólidos petrolizados, se realizó la caracterización microbiológica del lodo residual o fango digerido de una planta de tratamiento de aguas residuales urbanas, en el que se aislaron 11 cepas de bacterias aerobias, de éstas se identificaron 5 cepas Gram negativas, que resultaron ser géneros comúnmente aislados de suelos contaminados por hidrocarburos y residuos sólidos petrolizados. De los microorganismos aislados, 7 cepas fueron capaces de utilizar todas las fracciones del petróleo como única fuente de carbono y energía, lo que hace factible la utilización del fango digerido caracterizado como fuente de microorganismos degradadores de hidrocarburos en el proceso de biorremediación de residuos sólidos petrolizados y de suelos impactados por hidrocarburos, además del aporte de nutrientes que presenta su utilización.

Palabras claves: lodo residual, fango digerido, microorganismos, cepas, biorremediación, hidrocarburos.

Introducción

Un lodo residual es una materia orgánica húmeda con una cierta cantidad de aditivos, entre los cuales hay algunos que resultan de interés aprovechar por su importancia como nutrientes del suelo y otros cuya presencia es indeseable por su posibilidad de contaminación.

El fango digerido o lodo residual de las plantas de tratamiento de aguas residuales domésticas constituyen una fuente importante de nutrientes y de microorganismos. Las características físicas y químicas de los lodos varían en función de su origen, urbana o industrial, y del tipo de proceso al que han sido sometidos. (Ameneiros, 2003)

Actualmente no se encuentra una disposición ambientalmente segura para estos desechos en Cuba y en países del área del Caribe, donde se incrementarán los volúmenes de éstos residuos en los próximos años por la instalación de nuevas plantas.

Según estudios preliminares reportados por algunos autores (Acosta, Infante y otros, 1995)(Álvarez y col., 2004), se obtienen buenos resultados en el proceso de Biorremediación de suelos impactados por hidrocarburos como aceleradores del proceso y como fuente de nutrientes para el desarrollo y crecimiento de los microorganismos.

Es objetivo del presente trabajo caracterizar e identificar los microorganismos presentes en el fango digerido o lodo residual de la planta de tratamiento de aguas residuales urbanas Río Quibú en Cuidad de la Habana, con vistas a su posible utilización como acelerador en el proceso de biorremediación.

Materiales y Métodos

La muestra de lodo residual o fango digerido fue tomada puntualmente en la descarga final de lodos residuales o fangos digeridos hacia el lecho de secado de la planta de tratamiento de aguas residuales urbanas Río Quibú. La muestra fue envasada en frascos estériles de 1 litro de capacidad y conservadas en frío hasta su utilización en el laboratorio de microbiología (ISO 10381–6, 1993).

Conteo de los microorganismos del Fango digerido.

• Conteo de bacterias aerobias, hongos, levaduras y bacterias degradadoras

Se pesaron 10 g del Fango digerido y se añadió a un Erlenmeyer de 250 ml que contenía 90 ml de medio Solanas (Solana, A.M.1985) y unas gotas de tween 80 para facilitar la homogenización, se incubó en zaranda termostatada a 150 rpm durante 30 min. Se tomó del sobrenadante y se realizaron diluciones seriadas en solución salina hasta 10 -8 (ISO 6887, 1993). Las diluciones se sembraron en placas por duplicado en medio de Agar Triptona soya para el conteo total de bacterias aerobias (ISO 4833:1991). Paralelamente las diluciones se sembraron en placas con Agar petróleo (Finnerty, 1983) para el conteo total de bacterias degradadoras de hidrocarburos. Se realizaron inoculaciones en Agar Malta con un 5% de Cloruro de sodio (BIOCEN, 2001) para el conteo de hongos filamentosos y levaduras (ISO 7954: 1987).

Los resultados se reportan como unidades formadoras de colonias (células) por gramo de suelo según la fórmula siguiente:

donde:

Cs: número de unidades formadoras de colonias en el volumen de referencia elegido (UFC/gcrudo)

Vs: Volumen de referencia escogido para expresar la concentración de microorganismos en la muestra (ml)

N: suma de todas las colonias contadas

n1, n2,…, ni: número de placas por cada dilución

F1, F2……Fi: dilución usada en cada volumen

V1, V2…..Vi: volumen usado en la dilución (ml)

Aislamiento de las bacterias degradadoras de hidrocarburos

Las colonias más representativas crecidas en Agar petróleo se sembraron por agotamiento en medio Agar triptona soya y se incubaron a 37 o C por 24 h. Para la caracterización cultural se observaron las colonias al estereoscopio y para definir las características morfológicas tintoriales se realizó la tinción de Gram. (Bergey´s Manual, 1974)

• Caracterización de las cepas degradadoras

Degradación de Resinas y Asfaltenos: Para determinar la capacidad de estas cepas de degradar crudo pesado se añadió 1% de residuo de destilación mayor que 347 oC y residuo de destilación mayor que 465 oC de Crudo Seboruco en tubos con 9 ml del medio Solanas. El medio se inoculó con una asada del cultivo de la cepa, los tubos se incubaron durante 21días a 37 0C con un indicador de crecimiento.

Hidrocarburos Alifáticos: Para la determinación de la capacidad de utilización de fracciones de hidrocarburos alifáticos del petróleo como única fuente de carbono se añadió 1 % de queroseno y 1% de Isooctano por separado en tubos con 9 ml de medio Solana. El medio se inoculó con una asada del cultivo de la cepa y se incubaron durante 21 días a 37 0C con indicador de crecimiento.

Hidrocarburos Aromáticos: Para la determinación de la capacidad de utilización de fracciones de hidrocarburos aromáticos se utilizó 1% de Naftaleno (poliaromático) y 1% de Tolueno (Aromático alquilado) en medio basal Solanas por separado. El Naftaleno, como es un sólido insoluble en agua, se disolvió primero en acetona y luego se añadió al medio. El medio se inoculó con una asada del cultivo de la cepa y se incubaron durante 21 días a 37 0C con indicador de crecimiento.

Identificación de las cepas degradadoras: A partir de cultivos frescos de las cepas que crecieron en todos los medios de caracterización se inocularon los Kit de identificación (API 20 NE, 2002) para la identificación de microorganismos Gram negativos no enterobacterias.

Resultados y Discusión

• Conteo y aislamiento de bacterias degradadoras del Lodo Residual o Fango Digerido de la planta de tratamiento de aguas residuales del Río Quibú.

En la tabla 1 se muestra el resultado de la caracterización microbiológica del Fango digerido, conteo total de las colonias de bacterias aerobias, hongos y levaduras y microorganismos degradadores expresados en UFC/g.

Tabla. 1. Caracterización microbiológica del Fango digerido, expresados en UFC/g.

El número de bacterias aerobias alcanzó valores de 109 UFC/g , los hongos y levaduras hasta 105 UFC/g y los microorganismos degradadores de hidrocarburos resultó elevado con valores que alcanzan hasta 106 UFC / g. Estos resultados se corresponden con la amplia flora característica de los suelos (Bergeys, 1984).

Tabla. 2. Caracterización física – química del Fango digerido. (Álvarez y col., 2004)

HCTP: hidrocarburos totales del petróleo

Este sustrato constituye una fuente rica de materia orgánica con altos contenidos de nitrógeno, fósforo y potasio donde aparece un por ciento elevado de grasas y aceites e hidrocarburos totales disueltos en el sedimento con alta biodisponibilidad, además de poseer un pH adecuado para el desarrollo y crecimiento de una abundante microbiota adaptada al consumo de crudo y sus derivados como única fuente de carbono.

Del Conteo total de bacterias aerobias se aislaron 11cepas aparentemente diferentes. En la tabla 3 aparecen las características culturales morfológicas de cada una de ellas.

Según se aprecia en la tabla 3, las bacterias presentaron morfología colonial diversa, lo cual está en concordancia con la riqueza nutricional del lodo residual de donde provienen. Las bacterias aisladas resultaron ser 5 cocobacilos positivos, 3 cocobacilos negativos, 2 bacilos negativos y 1 bacilo positivo.

Tabla3. Características culturales y tintoriales de las cepas aisladas

El estudio microscópico mostró formas bacilares, cocobacilos, Gram positivos y negativos, márgenes lisas e irregulares, convexas y planas, de colores verdes, amarillas y rosadas.

Caracterización de las cepas aisladas degradadoras de hidrocarburos

En la tabla 4 se reportan los resultados de la caracterización de las cepas aisladas del lodo residual o fango digerido utilizando como fuente de carbono y energía las diferentes fracciones del petróleo.

Tabla 4. Resultados de la caracterización de las cepas aisladas del residuo con los diferentes hidrocarburos.

Las cepas LR-1, LR -2, LR -3, LR -5, LR -7c, LR -9 y LR -13 crecieron en todos los medios con los diferentes sustratos como única fuente de carbono y energía (Tabla 4), estas bacterias tuvieron un óptimo crecimiento al final de la incubación con turbidez y cambio de color (Fig. 6), siendo capaces de degradar todas las fracciones de hidrocarburos a la que fueron expuestas, por lo que constituyen cepas promisorias para ser utilizadas con diferentes fines degradativos en suelos impactados por hidrocarburos y donde el conteo de microorganismos degradadores de hidrocarburos se encuentre por debajo del rango establecido, entre 10 3 y 10 4 UFC/g, para aplicar el proceso de Biorremediación.

La versatilidad nutricional de las cepas identificadas en estos desechos resulta de significativa importancia, debido a que en el mundo, son pocas las especies microbianas reportadas con potencialidades para degradar todas las fracciones de hidrocarburos simultáneamente. Algunos autores, (Whyte, Bourbonnié y Creer, 1997), reportan que la mayoría de las cepas degradadoras de hidrocarburos pueden mineralizar los compuestos poliaromáticos o alifáticos pero no ambos, sugiriendo que estas dos vías pueden ser excluyentes en muchos casos. Sin embargo, en muchas bacterias se han observado los genes que codifican para las enzimas alcano-monooxigenasa y catecol 2,3 dioxigenasa, lo cual indica que las vías degradativas para alcanos e hidrocarburos aromáticos simples alquilados pueden encontrarse simultáneamente.

Las cepas de bacterias aerobias aisladas e identificadas del lodo residual o fango digerido de la Planta de Tratamiento de aguas residuales urbanas del Río Quibú capaces de degradar todas las fracciones de hidrocarburos, pueden servir como materia prima para la obtención de bioproductos (inóculos), para ser empleados en suelos contaminados por hidrocarburos y donde no sea posible la aplicación del proceso de Biorremediación por la técnica de la bioestimulación de los microorganismos autóctonos (Ej. manglares).

Conclusiones y Recomendaciones

El lodo residual o fango digerido caracterizado constituye una fuente importante de nutrientes y microorganismos degradadores de hidrocarburos, por lo que es promisoria su utilización en el proceso de biorremediación de residuos sólidos petrolizados y de suelos impactados por hidrocarburos.

Se identificaron 5 cepas Gram negativas, resultando ser géneros comúnmente aislados de suelos contaminados por hidrocarburos y residuos sólidos petrolizados.

Del total de las bacterias aisladas del lodo residual estudiado, siete resultaron las de mejores resultados biodegradativos utilizando al crudo y sus derivados como única fuente de carbono y energía. Las cepas denominadas LR-1, LR -2, LR -3, LR -5, LR -7c, LR -9 y LR -13, son promisorias para su aplicación en diferentes procesos de Biorremediación.

Las cepas aisladas e identificadas del lodo residual o fango digerido pueden ser utilizadas como materia prima para la obtención de bioproductos (inóculos), que pueden ser empleados en el proceso de biorremediación.

Se recomienda evaluar la factibilidad de utilización de los lodos residuales o fangos digeridos de las plantas de tratamiento de aguas residuales domésticas e industriales como fuentes de nutrientes y de microorganismos biodegradadores de hidrocarburos en el proceso de Biorremediación de residuos sólidos petrolizados y suelos contaminados por hidrocarburos.

Se debe estudiar la posibilidad de obtención de bioproductos y biosurfactantes a partir de las cepas aisladas e identificadas del lodo residual.

References

2. Acosta, I; Infante, C. López, W (1995). "Efecto de lodos petrolizados y lodos de tratamiento de aguas servidas sobre un suelo calciorthids de la península de Paraguaya". Agronomía Trop. 45(4): 527-537.
3. Álvarez, JA, y col. (2004). "Aplicación de la Biorremediación para tratar los residuales sólidos petrolizados de fondos de tanques de la Refinería Ñico López." P 2507, E03. CUPET. C. Habana, Cuba.
4. Ameneiros, J.A, García, O (2003). "Composteo de lodos generados en sistemas de tratamiento de aguas residuales", CIMAB, La Habana, Cuba
5. Api 20 NE (2002). Bio Mérieux SA. 07615B-11/97. 1-5.
6. Bergey´s (1974). Manual, the Systematic Bacteriology, Volumen I y II
7. Bergey´s (1984).Manual, the Systematic Bacteriology, Volumen I y II
8. Finnerty, W. R., Schokley, K., and Attaway, H, (1983). Microbial desulphurization and denitrogenation of hydrocarbons. Microbial Enhanced Oil Recovery. Penn Well Books, Tulsa, Oklahoma: 83-91
9. ISO 10381 – 6:1993, (1993). (E). International Standard. Guía para la colección, manejo y conservación del suelo para procesos microbianos aeróbicos en el laboratorio.
10. ISO 6887:1993. (1993) (E). International Standard. Microbiology: General guidance for the preparation of dilutions for microbiological examination (1993).
11. ISO 4833:1991(1991) (E). Microbiology-general guidance for the enumeration of microorganism colony count technique at 30 ° C.
12. ISO 7954:1987 (1987) (E) Microbiología: Guía general para la enumeración de hongos y levaduras. Técnica del conteo de colonias a 25 oC.
13. Medegan, MT (1998). Brock: Biología de los microorganismos 8va ed. Madrid, España
14. Ron, E. Z. y Rosenberg, E (2002). Biosurfactants and Bioremediation. Current opinion in biotechnology 13: 249 – 252.
15. Solana, A.M (1985). Biodegradación marina en la contaminación por hidrocarburos. Mundo Científico. 1(8): 913-920.
16. Whyte, L.G., Bourbonniére, L y Greer, C.W (1997). Biodegradation of petroleum hydrocarbons by psychrotropic Pseudomonas strain possessing bonth alkane (alk) and naphthalene (nah) catabolic pathways. App. Environ. Microbiol. 62(9): 3719-3723.

José Alfonso Álvarez González

Gisela Novoa Rodríguez

Silvia Acosta Díaz

Ricardo Campos Rodríguez

Miguel A. Díaz Díaz

Sandra Millar Palmer

Cristina Laffita Rivera

Centro de Investigaciones del Petróleo, Washington # 169, Cerro, Ciudad de la Habana, Cuba.