Rompimiento celular

Caldo de Fermentación Con Células Proteínas Intracelular Separación de Células Rompimiento Celular Separación Material Intracelular Sobrenadante Sin Células •Células inmovilizadas •Células retenidas Precipitación Ácidos Nucleicos, Proteasas Tratamiento de cuerpos incluidos Concentración Purificación Alta Resolución Refinamiento Permite •Altos niveles de pureza •Estabilidad del producto

Membrana celular Estructura de la membrana celular La características de las membranas nos permiten diferenciar a las bacterias en 2 tipos: – Gram-negativas Como modelo se utilizará un bacteria Gram-negativa, no tiene núcleo y todo su material genético se encuentra en una simple cadena de DNA, un ejemplo es la E.coli, ampliamente utilizada como huésped en la mayoría de proteína recombinantes. – Gram-positivas Entre ellas las bacterias del tipo Bacillus.

Gram-negativas La estructura de una Gram-negativa involucra tres capas : Membrana externa: 8nm de ancho, polímero que contiene proteínas y lipopolisácaridos. Peptidoglucano: Delgada capa de peptidoglucano. Espacio periplasmático: 8 nm de ancho, donde a menudo se localizan algunas enzimas.

Membrana plasmática : Compuesta de fosfolípidos, pero contiene proteínas dispersas e iones metálicos, estas moléculas de lípidos, tienen dos partes una parte hidrofóbica y una hidrofílica. La parte hidrofóbica o cola, a menudo contiene dos grupos alquilos, y la parte hidrofílica o cabeza a menudo tiene un grupo cargado, o un grupo alcohol. La cola hidrofóbicas suelen agruparse con otros grupos hidrofóbicos y las cabezas son expuestos al agua

Gram-positivas Gram-positivas involucra sólo dos capas : •Peptidoglucano •Espacio periplasmático •Membrana plasmática En el caso de las bacterias de este tipo la capa de peptidoglucano presenta condiciones de mayor resistencia que en bacterias gram- negativas, motivo por el cual no resultan necesariamente más fáciles de romper.

Funciones de las membranas Cada membrana tiene diferentes funciones: La membrana externa y la capa de peptidoglucano proporcionan la resistencia mecánica y su ruptura es lo fundamental para la ruptura de células. La membrana plasmática es muy débil y controla la permeabilidad de la célula, lo que incluye el transporte de nutrientes al interior de la célula y la exportación de metabolitos “en el interior de las soluciones circundantes”. El interior de la célula llamado citoplasma, es una solución acuosa de sales, azúcar, amino ácidos y biopolímeros. En los biopolímeros se incluyen proteínas, muchas de ellas enzimas, RNA y DNA.

Células Procariotes En los procariotes ocurre que las proteínas se encuentran en solución, pero en muchos procariotes modificados se sintetiza un exceso de proteínas las cuales precipitan en el interior del citoplasma (muchas veces éstas son las proteínas que se desean recuperar). En algunos casos sólo se quiere remover algunas de las capas para liberar alguna proteína específica.

Células Eucariotes En el caso de las células eucariotes, que poseen un núcleo y son estructuras más complejas que las procariotes, tienen una membrana alrededor de las células similar a las que tienen las procariotes. La membrana de las eucariotes contiene organelos, como las mitocondrias que son las responsables de la respiración y los núcleos que contienen el DNA en los cromosomas. Cada estructura está rodeada de una membrana similar a la membrana celular interna de los procariotes.

¿Cuándo se usa? ROMPIMIENTO DE CÉLULAS ( Cell Disruption) Los procesos de bio-separación se inician con una separación de la biomasa desde el resto del cultivo. En muchos casos los productos se encuentran en el medio. En estos casos la biomasa se descarta y hasta se puede vender como sub-producto. Pero en otros casos el producto de interés se encuentra en el interior de las células, en particular la mayoría de las proteínas producidas por manipulación genética de bacterias que no segregan las proteína al medio, pero que son precipitadas en el interior de la células en forma de cuerpos incluidos (“inclusion bodies”) . Se trata de proteínas intracelulares.

Procesos y Equipos La liberación de las proteínas intracelulares involucra la ruptura o permeabilización de la pared celular. Los equipos involucrados en esta etapa no han sido diseñados especialmente para el área biotecnológica sino que son prestadas de otras áreas (área de alimentos, de pinturas y pigmentos). Este rompimiento o permeabilización se puede llevar a cabo por dos métodos: •Métodos No- Mecánicos •Métodos Mecánicos

La selección de una u otra técnica dependerá las características del producto que se desea purificar, tales como: •Resistencia a: • Medios alcalinos. • Solventes. • Detergentes. • Enzimas. • Temperatura. • Esfuerzo de corte. La técnica utilizada determinará el tamaño de los desechos que se producirán.

Métodos No-Mecánicos Pueden ser de dos tipos: •Agente químicos •Solventes orgánicos • Detergentes • Alcalis • Agua (shock osmótico) •Enzimáticos se trata de enzimas que permeabilizan en forma selectiva las membranas celulares, tales como lisozima, glucanasas, mananasas, etc. Los métodos no-mecánicos son fáciles de escalar, si uno necesita tratar 10 veces más materia orgánica basta con adicionar 10 veces más reactivo químico o enzimático.

Métodos No-mecánicos Técnicas Permeabili- zación Enzimático Principios Permeabilización de la pared celular, lo cual produce el rompimiento de la Stress Suave Costos Caro Ejemplos Tratamiento de M. lysodeikticus con lisozima. célula Shock Osmótico Solubiliza- ción Ruptura Osmótica de la membrana Disolución de la membrana celular Suave Suave Barato Moderada- mente Caro Ruptura de Células de Glóbulos Rojos. Rompimiento de bacterias con con detergentes SDS. Disolución de Lípidos Solventes orgánicos que disuelve la pared celular y también la Modera do Barato Rompimiento de levaduras desestabilizan con tolueno. Tratamien- to con álcalis Solubilización de la membrana por saponificación de los lípidos Fuerte Barato

de Métodos Mecánicos El rompimiento se lleva a cabo por acción mecánica, pudiendo ser: • Fricción • Efecto de la presión • Colisiones. Estos métodos incluyen las operaciones unitarias ultrasonido, homogenización , molinos de bolas, etc. Estos métodos resultan ser agresivos con las proteínas de interés, debido principalmente a la generación de calor. Adicionalmente, el escalamiento resultan ser un problema significativo.

Métodos Mecánicos Técnicas Homogeni- zador de cuchillos Homogeni- zador alta presión Ultrasonifi- cación Principios Las células son rotas en un mezclador Las células son forzadas a pasar a través de un pequeño orificio lo que produce que se rompan por el esfuerzo de corte Las células son quebradas en una Stress Moderado Fuerte Fuerte Costos Moderado Moderado Caro Ejemplos Rompimiento de tejidos y células animales. Tratamiento a gran escala de suspensión de células. Rompimiento de suspensiones de cavidad ultrasónica células a lo menos en pequeña escala Molienda Las células son Moderado Barato rotas por medio de una molienda con abrasivos Molinos de bolas Las células son trituradas con bodas de acero o Fuerte Barato Rompimiento a gran escala para suspensiones de células y células de vidrio plantas

Rompimiento Celular Métodos No- Mecánicos

Métodos No-mecánicos Técnicas Permeabili- zación Enzimático Principios Permeabilización de la pared celular, lo cual produce el rompimiento de la Stress Suave Costos Caro Ejemplos Tratamiento de M. lysodeikticus con lisozima. célula Shock Osmótico Solubiliza- ción Ruptura Osmótica de la membrana Disolución de la membrana celular Suave Suave Barato Moderada- mente Caro Ruptura de Células de Glóbulos Rojos. Rompimiento de bacterias con con detergentes SDS. Disolución de Lípidos Solventes orgánicos que disuelve la pared celular y también la Modera do Barato Rompimiento de levaduras desestabilizan con tolueno. Tratamien- to con álcalis Solubilización de la membrana por saponificación de los lípidos Fuerte Barato

Tratamiento enzimático Teoría Existen enzimas que pueden hidrolizar la membrana celular de microorganismos. Cuando la membrana ha sido suficientemente permeabilizada, algunos compuestos intracelulares pueden ser liberados al medio. Una comparación entre un proceso de rompimiento y otro de permeabilización.

Metodología El modo de acción es muy simple basta con agregárselo a una suspensión y se produce una reacción muy rápida la cual deteriora la pared celular. La reacción es selectiva y ataca a determinadas estructuras de la pared celular como son las glucanasa, mananasas. Ventajas: Método suave y selectivo escalable Desventajas: escala. Costo de la enzima lo hace difícil de utilizar a gran Microorganismo Bacterias Levaduras Células de plantas Enzima Lisozima Complejo glucanasa- mananasa Celulosas y peptinasas Efecto Ruptura de los enlaces ß-1,4 entre N-acetil murámico y N- acetil glucosamida Rompe la capa de glucano y de manano Rompen capa de celulosa y peptino

y Shock Osmótico Teoría Resulta ser uno de los métodos más simple: 1. Las células se colocan en una volumen de agua 2 veces mayor que el volumen de células. 2. Bajo estas condiciones las células se hinchan, debido a un simple flujo osmótico que se produce debido a que las células contienen solutos (los causantes del flujo osmótico de agua al interior de la célula). 3. Las células se hinchan y algunas llegan a reventarse. La susceptibilidad de las fuertemente de su tipo. células es relativa depende

Los glóbulos rojos son fáciles de lisar. Las células vegetales son muchos más difíciles, dado que sus paredes contienen compuestos que son impermeables al flujo osmótico. Se puede calcular la presión necesaria para romper células a partir de la ley van´t Hoof. La cual se deduce desde la condición de equilibrio : DP = – R*T*c1 Donde c1 : Concentración de solutos en el interior de la célula. En el caso de una célula que contiene una concentración de solutos del orden de 0.2 M, calculando la diferencia de presión alcanzara valores del orden de -5 atm (dentro mayor presión que afuera).

Solubilización Teoría Es uno de los método no-mecánico rompimiento de células. más utilizado para el Los detergentes tienen una zona hidrofílica y otra hidrofóbica, por esta razón pueden interactuar tanto con el agua como con los lípidos. Su habilidad se basa en la solubilización de los lípidos de la pared celular. Los detergentes más utilizados son de tres tipos: •Detergente aniónico •Detergente catiónico •Detergente no-iónico y polidispersante

Ejemplos Detergentes aniónicos •Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) CH3(CH2)11 SO3- Na+ •Sulfonato de Sodio CH3(CH2)9 -Phenyl-SO3- Na+ •Tauroclorato de Sodio El SDS es uno de los detergentes aniónicos más ampliamente estudiados. Entre los materiales aniónicos se encuentran los jabones (sales de ácidos grasos), estos jabones dependen del grupo de ácido carboxílico que tengan y resultan efectivos a altos pH donde el grupo se encuentra ionizado. A su vez resultan ineficientes en aguas duras que contengan iones calcio que pueden reaccionar con ellos y formar compuestos insolubles. Las desventajas de los detergentes tradicionales se puede superar si se reemplazan los grupos carboxilos por grupos sulfatos. Los sulfatos que contienen grupos fenilos son más efectivos que los compuestos que contienen grupos alquilos, debido principalmente que no son fáciles de degradar microbianamente, como son los detergente utilizados para lavado.

Ejemplos Detergentes cationicos •Bromuro de Catiltrimetil Amonio (CTAB) CH3(CH2)15 N+ (CH3)3 Br- Son detergentes más suaves (tipo shampoo), por lo cual se produce un rompimiento más suave de las células. Ejemplos •Triton X-100 Detergente no-iónicos C8H17-Phenyl-(OCH2CH2)9.5OH Son generalmente polímeros solubles en agua, se utilizan en los detergente para lavar vajilla. Estos detergente también tienen una parte hidrofóbica y una hidrofílica, pero la parte hidrofílica no es ni un sulfato ni un tetraalquilamonio sino un alcohol. .

A bajas concentraciones de detergente no se produce degradación de los lípidos, pero a alta concentración se produce una degradación que resulta lineal a la concentración de detergente, junto a esta variable también se altera la tensión superficial de la solución. La relación que se produce entre la solubilización y otros fenómenos es que el detergente forma micelas, en cuyo interior se encapsulan los lípidos digeridos (Cabezas hidrofílicas y colas hidrofóbicas que están en contacto con la sopa de lípidos).

Procedimiento 1. Se coloca un determinado volumen de detergente concentrado por un volumen de células. Generalmente la mitad de volumen de detergente que de volumen de células. 2. El detergente rompe la membrana celular. 3. La suspensión resultante se centrifuga para remover los fragmentos de células y luego se pasa a través de una columna de adsorción o por etapas de extracción para aislar el producto.

Tratamiento con solvente (disolución de lípidos) Es una técnica la cual no ha sido muy documentada, sólo se requiere de información experimental. Una buena forma de seleccionar el solvente es analizar la volatilidad (desde manuales), este parámetro puede relacionarse con las interacciones lípido solvente, poniendo atención en el calor de mezcla. Solventes con similar solubilidad atacarán los lípidos de forma similar. Procedimiento 1. El método consiste en adicionar la suspensión de biomasa un volumen de tolueno del orden de un 10% de biomasa. 2. El tolueno es absorbido por las células, las cuales se hinchan y luego explotan. 3. El contenido de las células se libera al medio y luego puede ser separado.

• • • • • Existen otros solventes que puede ser utilizados como : Benceno ( que es cancerigeno y de una alta volatilidad, el tolueno también es cancerigeno pero de más baja volatilidad). Cumeno Clorobenceno Xileno Octanol (Altos alcoholes)

Tratamiento alcalino Es un tratamiento bastante fuerte, no selectivo y barato. Algún álcalis es agregado a un suspensión de células, el álcalis reacciona con la pared celular en diversas formas, produciendo la saponificación de lípidos. Desventajas : Una alta concentración de álcalis puede hasta producir la denaturalización de las proteínas (destruyendo el producto). Resulta la opción menos utilizada.

Rompimiento Celular Métodos Mecánicos Unidad II Ingeniería de Bioseparaciones

MÉTODOS MECÁNICOS Los métodos mecánicos se pueden dividir en dos tipos : Métodos a pequeña escala son : •Ultrasonificación •Molina con abrasivos •Homogenizadores Métodos a gran escala •Homogenizadores •Molinos de bolas a alta presión Ambos son operaciones unitarias típicas de la Ingeniería de Procesos y de la industria de alimentos.

MÉTODOS MECÁNICOS Pequeña Escala

2. 3. 4. 5. 6. 6 Desintegración completa de una célula Para determinar el contenido de proteínas total de una célula se debe realizar la desintegración total de ellas, para ello se utiliza la siguiente metodología: 1. Se adicionan 1 volumen de bolas de vidrio en un ependorf. 1-3 4-5 Se adiciona 1 volumen de las células a desintegrar (en forma de pasta, previamente separadas del caldo) Se adiciona 0.5 volumen de buffer, se puede adicionar algún detergente (SDS, Triton X-100) Se agitan fuertemente en un vortex, entre 2 y 5 minutos (controlando que no se caliente) Se repite el punto 4 hasta asegurarse que no se rompen más las células. Se separan los desechos de la solución y se analiza la concentración de proteínas. 100% Rompimiento

Ultrasonificación Se utilizan frecuencias de 20 Khz esto produce vibraciones que provocan el fenómeno de cavitación. • Se producen zonas de baja presión en el líquido • El líquido se transforma en gas formándose pequeñas burbujas • Las burbujas colapsan debido a los cambios de presión. • Se producen fuertes esfuerzos de corte en el líquido que rompen las células. Ultrasonicador

Molienda con abrasivos Procedimiento: 1. Se utilizan un recipiente donde se agrega algún agente abrasivo, como bolas de vidrio. 2. El sistema se hace vibrar lo que produce: • Colisiones de las bolas con la biomasa • Fuertes esfuerzos de cortes • Se produce la ruptura de las células. 3. Posteriormente, se separan las bolitas y desechos celulares y se recupera el sobrenadate.

Homogenizadores La idea es generar altos esfuerzos de corte que produzcan la ruptura de las células. Los altos esfuerzos de corte se pueden obtener por: 1. Embolos 2. Cuchillas 3. Pistones Émbolos Cuchillas Pistones

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