Cultivo del hongo Reishi (Ganoderma lucidum) en sustratos artificiales

El hongo Ganoderma lucidum también conocido como Reishi o Lingzhi es farmacológica y comercialmente el hongo medicinal más importante en el mundo con un comercio global actual de aproximadamente 2 mil millones de dólares. Se reporta que el Reishi posee una multitud de valores medicinales muy significantes – anticancer, anti-VIH, antiataques al corazón (reducción del colesterol así como anti-angiogenico), Hepato – y nefrotoprotectivo, hipoglicémico (anti-diabetes), etc. En el sistema de medicina china y japonesa el Reishi es casi una panacea.

G. lucidum es un Basidiomycete perteneciente al Orden Poliporales y la familia poliporaceae. En su estado verde el hongo es suave, duro y plano, destacándose por la presencia de un sombrero (píleo), lateralmente estipitado, de hasta 8 cm en la parte más ancha, rojo barniz brillante, generalmente de tonos más claros hacia el margen, arriñonado en forma de tapa y, dependiendo de la edad presenta colores que van del blanco al negro pasando por tonalidades amarillentas, marrones, azules, rojas, moradas y violáceas en la zona de los poros. El tallo (estipe o estípite) situado lateralmente en el píleo, es pálido, escabroso hacia el sombrerillo, de 10 cm de alto y 2 cm de ancho. Sus esporas de pared doble, ambas interconectadas por pilares, pared interna castaño-amarillenta, pared externa hialina. No obstante, la morfología como así el tamaño presenta variaciones ostensiblemente, ya sea por tratarse de diferentes variedades o cepas, como por las diferentes condiciones ambientales en el que se desarrolla. Cuando se dan elevados niveles de dióxido de carbono el resultado es una fuerte elongación del tallo. G. lucidum es común de encontrar en la base del tallo de manzanos, robles, álamos, sauces, olmos, abetos, etcétera del campo vivos o moribundos

Si bien se trata de una especie conocida desde hace más de 4000 años, los avances en el cultivo producto de estudios realizados para propósito vienen ocurriendo en los últimos 30 años. En la antigüedad el Ganoderma lucidum era recolectado en sus hábitats naturales, creciendo sobre la corteza de ciruelos, arces, robles, olmos, álamos, sauces, etcétera de zonas húmedas tropicales o templadas, bosques con las condiciones de altura, humedad y temperatura (28°C-32°C) óptimas para el desarrollo del mismo. Sin embargo hoy en día el Ganoderma lucidum se cultiva en hábitats artificiales (sobre sustratos artificiales en base a aserrines) que permiten el crecimiento y el desarrollo del hongo en condiciones prácticamente idénticas a las naturales, y con ello su mayor disponibilidad para la población en general. Se puede distinguir dos tipos de cultivos: sobre troncos y sobre sustratos artificiales en condiciones estériles.

Resumen

Primeramente se llevan a cabo aislamientos de cultivos puros de micelio de Ganoderma lucidum en platos Petri en diversos medios de cultivo con agar, los cuales se pueden desarrollar a 24-28ºC. Luego, las cepas se preservan en tubos de ensayo con agar inclinado a 4ºC, de manera que se pueda recurrir a estas muestras conservadas si algo le pasa al cultivo de uso diario. Después sigue la transferencia del cultivo puro a una variedad de sustratos, en bolsas de polipropileno o frascos, para la preparación del inóculo de procreación en culltivos líquidos, grano de cereal o en aserrín-salvado, a 24ºC. Para el cultivo de los cuerpos fructíferos del hongo sobre sustratos artificiales se utilizan mezclas de aserrines apropiados, colocando 2 kg en bolsas de polipropileno, de 17.50 x 8.25 x 4.75 pulgadas, previamente esterilizadas a unos 121°C durante 120 minutos) con nutrientes básicos. Una vez frías se inoculan con micelio de Reishi (Ganoderma lucidum), 150 g/bolsa distribuyéndolo uniformemente, en condiciones asépticas, generalmente en una cámara de flujo laminar o en un cuarto muy limpio y esterilizado, e inmediatamente después, las bolsas se sellan con calor y se inflan con aire microfiltrado. Luego las bolsas inoculadas se incuban unas 16 semanas a temperaturas superiores a los 21-27°C a HR de 95-100%, la luz no es necesaria. Al término de este periodo las bolsas se perforan y se les retira su parte inferior, que es por donde comienzan a crecer los primordios, para lo cual se necesitan 18-24ºC, HR de 75-100% y 4-8 horas a 200-500 Lux. Finalmente, para el desarrollo de cuerpos fructíferos se deben mantener 21-27ºC, HR de 90-95% y luz de 12 horas prendido/apagado a 750-1500 Lux. Las cosechas se suelen hacer de forma consecutiva a 5 o 6 meses de iniciado el cultivo.

Cuando los hongos están completamente desarrollados, se cosechan e inmediatamente se deshidratan para posteriormente pulverizarlos, esterilizarlos y envasarlos.

Aislamiento de cultivos puros

Aislamiento en agar

El aislamiento micelio de la cepa se lleva a cabo en platos Petri en medio de cultivo harina de trigo (10 gr/ l) agar (1.5%) (Bioxon). Ganoderma también se puede cultivar sobre agar extracto de malta (Malt Extract Agar = MEA); agar harina de avena levadura (Oatmeal Yeast Agar = OMYA), agar alimento de perro (Dog Food Agar = DFA), papa dextrosa extracto de levadura (Potato Dextrose Yeast Agar = PDYA), adicionados de 1-15mg/l de sulfato de gentamicina.

Siembra del hongo Ganoderma.

• 1. Limpie la superficie externa para que no haya ninguno residuo suelto y frote con una solución de hipoclorito al 1% y 0.5 g de tiabendazol o benomil por litro de agua .

• 2. Rompa abriendo el píleo o "sombrero" del hongo (o la base del tallo) tan limpiamente como usted pueda.

• 3. Prenda su lámpara de alcohol y flamee la hoja de su bisturí. Luego corte un pequeño pedazo de tejido limpio del interior del hongo.

• 4. Con el bisturí transfiera varios pedazo (3-5) del hongo una placa de agar nutritivo (como los anteriormente recomendados).

• 5. Finalmente, apile las placas, envuélvalas en una bolsa de plástico limpia y póngalas en un lugar conveniente para incubar a temperatura de 24-28ºC.

El crecimiento micelial, si ocurre, debe hacerse visible en unos pocos días, extendiéndose hacia afuera del trozo de tejido del hongo. También pueden crecer hongos o bacterias contaminantes en cuyo caso usted tendrá que recortar un pedazo de micelio limpio y transferirlo a una placa nueva. Si usted decide subcultivar el micelio para separarlo de los contaminantes, asegúrese de hacerlo antes de que el contaminante haya madurado lo suficiente como para formar esporas. De lo contrario se estará transfiriendo el contaminante con el micelio de Ganoderma.

Preservación de la cepa

La cepa se registra y se mantiene en refrigeración en tubos de ensayo con agar inclinado a 4ºC. Una vez que se ha purificado el cultivo del hongo, se necesita preservar muestras del cultivo en forma segura por períodos largos, de manera que se pueda recurrir a estas muestras conservadas si algo le pasa al cultivo de uso diario. El método del almacenamiento simplemente requiere extraer por raspado un pedazo de micelio de una placa de agar y transferirlo a un tubo con tapa rosca conteniendo agua destilada esterilizada, aceite mineral o parafina líquida. Una vez en el agua destilada, aceite mineral o parafina líquida, el micelio del hongo se vuelve dormante y para muchas cepas durará alrededor de seis meses. Ni siquiera se requiere refrigeración, pero hay que mantenerlos a 4º para mayor seguridad. La liofilización del micelio conserva las cepas viables durante años.

Preparación del inóculo de procreación

Después del cultivo en agar, sigue la transferencia del cultivo puro a una variedad de sustratos para la preparación del inóculo de procreación: cultivos líquidos puros de inóculo micelial, inóculo de grano de cereal e inóculo en aserrín-salvado (Chen 1999).

Producción de inóculo en medio líquido.

Los cultivos líquidos puros pueden desarrollarse en caldo papa-dextrosa u otras formulaciones. El micelio de Ganoderma lucidum se adapta muy bien al cultivo líquido, el cual es tradicional en China. Para ello se emplea una suspensión de micelio fragmentado en agua esterilizada. Esta solución enriquecida de micelio, con miles de cadenas celulares diminutas se inyecta en el frasco de grano esterilizado. Con el agua, los fragmentos de micelio se percolan hacia abajo a través de los granos distribuyéndose homogéneamente, llegando a ser cada uno de ellos un punto de de desarrollo. Por varios días puede presentar poco o ningún signo de crecimiento. Hacia el día cuarto o quinto después de la inyección a temperatura óptima de incubación, se hacen visibles los sitios de crecimiento activo. En cuestión de horas, estas zonas se alargan y pronto el grano se encuentra rodeado por el micelio. Con esta técnica se evita la necesidad de sacudir repetidamente y un solo plato de micelio en agar puede inocular hasta 100 frascos, mas de 10 veces que el número inoculado con el método tradicional.

Para suspender el micelio se usa una jeringa esterilizada, se inyectan de 30 a 50 ml de agua esterilizada en un cultivo sano. Luego se raspa la superficie la superficie del cultivo para obtener el máximo de fragmentos de micelio. Cinco mililitros de esta suspensión son suficientes para inocular un frasco de aproximadamente 750 ml. Otra forma puede ser ensamblar una jarra esterilizable en autoclave a una licuadora; adicionar agua hasta 2/3 a ¾ partes de su capacidad, cubrir con lámina de aluminio, esterilizar, enfriar hasta temperatura ambiente. Introducir bajo condiciones asépticas en el vaso de la licuadora el cultivo entero de micelio de crecimiento vigoroso, partido en cuartos o en tirillas. Se recomienda no usar la parte periférica del cultivo porque allí pueden aparecer contaminantes. Prender la licuadora a velocidad alta por no más de 5 segundos. Cada frasco de ¼ de galón se inocula con 5-10 ml.

Producción de inóculo en grano de cereales.

El inóculo de los cultivos puros se coloca sobre grano de centeno, trigo o de otros cereales esterilizados típicamente en bolsas de polipropileno o frascos (1/4 y ½ galón) a 24ºC; la colonización se da en dos o tres semanas. Si el inóculo de grano (inóculo de procreación) no se usa cuando está maduro, ocurre una sobreincubación que dificulta la separación de los granos con agitación. En este caso se requiere de una herramienta para hacer la transferencia tal como una cuchara o un cuchillo esterilizado para separar los granos dentro del recipiente.

Producción de inóculo en aserrín. Para la formulación de substrato de aserrín-salvado como inóculo, vea el Cuadro 1. Otras formulaciones pueden encontrarse en Chen (1999).

Cuadro 1. Formulación de substrato para inóculo aserrín-salvado (Chen 1999).

Cada unidad de inóculo primario de ½ galón se puede expandir en 10 unidades de 5 libras de aserrín húmedo esterilizado. Una vez crecido el micelio en el grano, con cada frascos se pueden inocular 10 bolsas de 5 libras de aserrín con 65-70% de humedad. A una temperatura de 24ºC la colonización del sustrato se completa en 8 a 12 días. Los 10 bloques de inóculo de aserrín pueden expandirse en 100 a 200 bolsas de 2 kg de aserrína, que a su vez, son colonizadas en un período similar. El inóculo de aserrín resultante es el último paso antes de inocular un sustrato capaz de soportar carpóforo, ya sea en una mezcla de aserrín y viruta, leños o trozas (pedazos de troncos) que luego se entierran; Ganoderma spp también se puede cultivar en aserrín esterilizado organizado en columnas verticales.

Proceso de producción

Inoculación

El método desarrollado por Stamets (1993) consiste en inocular en una mezcla de aserrín (1:1), sustrato que se incuba en bolsas de polietileno. Durante 3-4 días, la mezcla de aserrín (aliso/roble) es humedecida y fermentada en agua enriquecida con melaza (50 ml/kg de sustrato), se empaca en bolsas autoclaveables (polipropileno) de 17.50 x 8.25 x 4.75 pulgadas a razón de 2 kg de medio de cultivo con una humedad entre 60 y 70%. El material empacado se esteriliza durante 2 horas a 15 psi (libras x pulgada cuadrada de presión). Cuando se enfrían se abren en un cuarto limpio. Se inoculan con micelio producido en grano de cereal o en grano/aserrín, a razón de 150 g por bolsa distribuyéndolo uniformemente. Las bolsas se exponen a la corriente de aire de una cámara de flujo laminar, inflándolas parcialmente, inmediatamente después las bolsas se sellan con calor. El aire en el interior de las bolsas crea un ambiente húmedo, presurizado positivamente. El intercambio de gases con el ambiente externo ocurre a través de un parche microporos.

Desde la inoculación hasta la cosecha, transcurren por lo menos tres meses con cualquiera de los métodos de ciclo rápido. La colonización es característicamente rápida y se completa en 10-21 días a 24°C. Después de 30 días los bloques se llevan al cuarto de crecimiento después de lo cual se perforan las bolsas; estas nunca se abren. Cada una se deja caer hacia abajo con fuerza y se hacen cortes en cruz en la cubierta plástica los cuales serán los sitios para la formación de los carpóforos en la superficie áspera del medio. Los cultivos se colocan en el cuarto de crecimiento y la cosecha de píleos sin estípite empieza normalmente en un mes.

Los cuerpos fructíferos (carpóforos) emergentes son de color blancuzco a amarillo dorado y típicamente de forma triangular. Su crecimiento es lento. Las formaciones como lenguas amarillean con la edad y se hacen progresivamente más pardo rojizos hacia la base. Hacia el día 50 a menudo han alcanzado cuatro pulgadas de longitud, están ramificados y se han levantado de múltiples sitios de la superficie plana del medio de viruta. Frecuentemente, los estípites en forma de cuerno tratan de salir por el parche de filtro y llegan a unirse a él. Una vez se haya logrado la longitud del tallo deseada, se debe alterar el ambiente para obtener el estado final. Si el cultivador no expone estos cuernos emergentes a condiciones atmosféricas muy parecidas a las naturales, la oportunidad del desarrollo del píleo pronto se perderán (Stamets, 1993).

Durante los dos primeros meses, todo el ciclo de crecimiento ocurre dentro del ambiente de la bolsa de plástico sellada, y por consiguiente contiene concentraciones relativamente altas de dióxido de carbón y otros gases. A menudo, la parte superior de la bolsa contiene niveles de CO2 que exceden las 20.000 ppm o el 2%. Cuando se abre la bolsa y prevalece el libre intercambio de gases, el dióxido de carbono baja a niveles normales de 350 ppm o 0.35%. Este cambio súbito en los niveles de dióxido de carbón es una señal clara para que se pueda iniciar el desarrollo del píleo de Ganoderma lucidum.

En su hábitat natural, este cambio es análogo a la emergencia del estípite desde el ambiente rico en bióxido de carbono por debajo del nivel del suelo. Una vez que emerge el estípite o estipe (tallo) sensible al CO2 al aire abierto, se desarrolla el píleo lateral fotosensible productor de esporas. Los píleos se forman por encima de la superficie y se orientan hacia la luz. Una indicación de crecimiento nuevo es la profundidad y la apariencia prominente de una banda blanca alrededor del borde del píleo.

Bajo estas condiciones, la formación del píleo es rápida y la época de la cosecha usualmente se indica por la carencia de un crecimiento nuevo de color blanco del margen y la producción de esporas pardo rojizas.

Las esporas, aunque se liberan por debajo, tienden a acumularse sobre la superficie superior del basidiocarpo.

El cultivador tiene dos alternativas para promover el desarrollo del píleo una vez han empezado a formarse. La bolsa de plástico puede dejarse o retirarse de la masa de sustrato incubado. Si el plástico protector se remueve y no prevalece un ambiente como de niebla, la evaporación masiva podrá detener el desarrollo de cualquier cuerpo fructífero. Si los bloques expuestos se mantienen en un ambiente de niebla dentro de la sala de crecimiento, disminuye el crecimiento vertical o cesa enteramente y empiezan a diferenciarse los píleos característicos horizontales en forma de riñón. Como los estípites, los márgenes del crecimiento nuevo son blancos mientras que las áreas envejecidas se tornan pardo brillante.

Los cultivadores de Asia inoculan botellas o bolsas cilíndricas de 1-2 litros, con un extremo estrecho taponadas con algodón (actúan como filtro). Una vez inoculadas, las bolsas o botellas se apilan horizontalmente dando la impresión de un muro. Después de 30-60 días, en dependencia de la cepa, la densidad de inóculo y las condiciones de desarrollo, se remueven los tapones de algodón. Los pequeños canales de CO2 abiertos estimulan la elongación de los estípites. Igualmente, la abertura conduce a la pérdida de humedad. Desde dichos portales, se disparan los primordios en forma de dedos hacia el ambiente altamente húmedo del cuarto de crecimiento.

Con este método de cultivo se conserva la humedad y se canaliza hacia el desarrollo de los cuerpos fructíferos. Bajo condiciones bajas de luz la elongación de los estípites disminuye a medida que el micelio entra en el período de formación del píleo; se cree que hay mejores oleadas (cosechas) protegiendo el cultivo de la evaporación que con el sustrato abierto a la atmósfera. Con esta estrategia un ambiente de niebla no es tan crítico como cuando el sustrato es expuesto completamente al aire, y además, la contaminación es menos probable.

Sustratos de fructificación:

En interiores sobre aserrín de maderas duras de plantas dicotiledoneas. La adición de salvado de arroz o de sorgo mejora la producción. Una adición mayor del 15% de masa seca de sustrato inhibe el desarrollo del cuerpo fructífero.

Algunas formulaciones para cultivar carpóforos de Ganoderma:

1. Aserrín 78%, salvado de trigo 20%, yeso 1%, soya en polvo 1%.

2. Bagazo de caña 75%, salvado de trigo 22%, azúcar de caña 1%, yeso 1%, soya en polvo 1%.

3. Cascarilla de algodón 88%, salvado de trigo 10%, azúcar de caña 1%, yeso 1%.

4. Aserrín 70%, olotes de maíz pulverizados 14%, salvado de trigo 14%, yeso 1%, ceniza de paja de cereal 1%.

5. Polvo de olote de maíz 78%, una mezcla de salvado de arroz y trigo 20%, ceniza de paja 1% (Chang y Buswell, 1999).

6. Aserrín de roble 80%, salvado de trigo no procesado 18%, sacarosa 1%, carbonato de calcio o sulfato de calcio 1%, humedad 67–70%.

Se recomiendan frascos y bolsas de polipropileno para la fructificación.

Cosecha:

Se perforan las bolsas, se producen primordios sin estípite bajo condiciones de buena iluminación y baja concentración de dióxido de carbono. Con esta estrategia, se quiebran limpiamente los carpóforos de los hoyos de ¼ de pulgada. Si se estimula la formación de estípites elevando el CO2 o disminuyendo la iluminación del ambiente, los hongos pueden cosecharse, torciendo primero la base del estípite desde el sustrato y luego se limpian los despojos de la base del pie. A una humedad relativa del 50%, las setas se deshidratan rápidamente al aire abierto a temperatura de salón. Después de la deshidratación, algunos cultivadores esterilizan sus setas con un ciclo corto, en autoclave. Este tratamiento térmico retarda o evita la eclosión de las larvas de cualquier huevo que haya sido depositado durante el desarrollo del hongo.

Las etapas más cruciales son la formación de los primordios y la formación de los carpóforos durante la transición de la fase vegetativa a la generativa. La luz y el oxígeno disparan la iniciación de los primordios; una breve exposición a la luz es suficiente para la iniciación de los primordios. Se puede acortar el peróodo de incubación usando: una cepa de alta calidad, una rata alta de nóculo vigoroso y fresco y temperatura de incubación óptima de 30°C. Si se requiere producir cuerpos fructíferos con píleo, es necesario manejar adecuadamente los niveles de CO2 como un factor morfogenético que determina si el hongo tendrá píleo o por el contrario será en forma de cuerno; en el primer caso, la concentración de dióxido de carbono debe ser de 0.03% y de aire fresco 0.1%; si la concentración de CO2 se encuentra en el rango de 0.1–1% durante el período de fructificación, se obtendrán carpóforos en forma de cuerno; la dirección de la luz es otro factor morfogenético, gracias a que Ganoderma es de naturaleza fototrópica.

Producción

La primera oleada (cosecha) puede producir de 125-200 g (peso húmedo) a partir de 2200 a 2300 g de sustrato húmedo inoculado en el sistema de vía rápida (90 días). Los carpóforos poseen 80% de agua, 10% menos que los hongos más carnosos. La segunda oleada (cosecha) produce entre el 25 y el 50% de la primera. Las trozas (leños) producen 1-2 libras por año (Stamets, 1993).

Resumen de los parámetros de cultivo:

Aislamiento de cultivos puros:

Temperatura: 24º.

Inóculo de procreación

Temperatura: 24ºC

Incubación

Temperatura: 21-27ºC

Humedad relativa: 95-100%

Tiempo: 10-20 días

CO2: tolera hasta 50.000 ppm o 5%

Intercambio de aire fresco: 0-1/h

Requerimientos de luz: no es idispensable

Formación de primordios en forma de cuerno

Temperatura de iniciación: 18-24ºC

Humedad relativa: 75-100%

Tiempo: 14-28 días

CO2: 20.000-40.000 ppm

Intercambio de aire fresco: 0-1

Requerimientos de luz: 4-8 horas a 200-500 Lux

Formación de primordios sésiles ("Young Conk")

Temperatura: 21-17ºF

Humedad relativa: 95-100%

Tiempo: 14-28 días

CO2: 5000-2000 ppm

Intercambio de aire fresco: como se requiera para mantener CO2 deseado.

Requerimientos de luz: 12 horas a 500-1000 Lux

Desarrollo del cuerpo fructífero

Temperatura: 21-27ºC

Humedad relativa: 90-95%

Tiempo: 60 días

CO2: <2000 ppm

Intercambio de aire fresco: como se requiera

Requerimientos de luz: 12 horas prendido/apagado a 750-1500 Lux

Ciclo de cosecha: dos cosechas en 90-120 días (Stamets, 1993).

Cuadro 3. Ganoderma lucidum: parámetros de desarrollo para el cultivo.

*Ponga la temperatura a 28oC, la temperatura actual puede llagar a ser 2-3oC más alta (calor generado por la respiración masiva del micelio).

Fuente: Chen 1999, Stamets 2000.

HR Humedad Relativa.

Cosecha y postcosecha

Cuando los hongos están completamente desarrollados, se procede a cortarlos e inmediatamente se deshidratan para por último pulverizarlos, esterilizarlos y envasarlos. Todos estos procesos se realizan en ambientes cerrados totalmente controlados donde el aire de la ventilación es filtrado, lo mismo que el agua de riego. El acceso es restringido lo que permite ofrecer un producto orgánico de la más alta calidad.

Desde la inoculación hasta la cosecha, transcurren menos de tres meses con cualquiera de los métodos de ciclo rápido. La maduración de frutos está indicada por la desaparición del borde blanco del cuerpo fructífero. En otros términos, en la superficie superior del píleo, el margen tiene color similar al centro, todo rojizo a café rojizo o amarillento a café amarillento en G. lucidum. El cultivo continua en humedad relativa 85% durante 7-10 días adicionales para estimular el desarrollo en espesor y firmeza del píleo (50-60% R.H. en otra práctica). Coseche cortando el estipe o estípite (tallo). Mantenga sólo 2 centímetro de la estipe con el píleo. Si así se desea, continúe el cultivo bajo parámetros de óptimo desarrollo para segunda y tercera cosecha (flushes), aunque las cosechas subsecuentes tienen rendimiento más bajo, sobre todo la tercera.

Seque inmediatamente los cuerpos fructíferos (carpóforos) cosechados, en aire seco bajo el sol o con calor (50-60ºC). Complete el secando dentro de 2-3 días. Cuando seque, ponga los cuerpos fructíferos con la parte inferior del píleo hacia abajo. Durante días nublados o lluviosos, aplique calor (60ºC). El secado prolongado inadecuado baja la calidad del producto; la parte inferior de la superficie porosa se torna café oscura o se contamina por mohos (hongos microscópicos).

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Autor:

José Ramírez Villapudua

Roque Abel Sáinz Rodríguez,

Profesores investigadores de la Universidad Autónoma de Sinaloa y Agrobiológica, S.A. de C.V.