- Resumen
- Aminoácidos, péptidos y proteínas. Una mirada básica y edificante.
- Síntesis de péptidos.
- Bibliografía.
Las proteínas, sn los componentes estructurales mínimos de toda organización compleja con vida: virus y microorganismos, células, tejidos, órganos y sistemas.
La estructura no solamente permite la continuidad de la vida si no el desarrollo fisiológico del mismo y la interacción y la replicación del ser vivo que compone.
Hoy en día, se han sintetizados miles de moléculas en el laboratorio, ya se puede obtener síntesis de cadenas peptídicas, sencillas y complejas, monitorizandolas bajo procedimientos sencillo de atracción y rechazo químico en entre aminoácidos. Aun así, aun no se ha completado el proceso hasta convertirlas a la compleja estructura cuaternaria por ello se apela a diseños sencillos, sin mayor elaboración. Este trabajo intenta explicar la sencillez y la complejidad del mismo y esperamos que sea un estimulo para todos aquello quines comienzan en el campo de la investigación de las estructuras proteicas.
2. Aminoácidos, péptidos y Proteinas. Una mirada basica y edificante.
2.1 proteinas, algunas nociones basicas
Las proteínas son los materiales que desempeñan un mayor numero de funciones en las células de todos los seres vivos. Por un lado, forman parte de la estructura básica de los tejidos (músculos, tendones, piel, uñas, etc.) y, por otro, desempeñan funciones metabólicas y reguladoras (asimilación de nutrientes, transporte de oxígeno y de grasas en la sangre, inactivación de materiales tóxicos o peligrosos, etc.). También son los elementos que definen la identidad de cada ser vivo, ya que son la base de la estructura del código genético (ADN) y de los sistemas de reconocimiento de organismos extraños en el sistema inmunitario.
Son macromoléculas orgánicas, constituidas básicamente por carbono (C), hidrógeno (H), oxígeno (O) y nitrógeno (N); aunque pueden contener también azufre (S) y fósforo (P) y, en menor proporción, hierro (Fe), cobre (Cu), magnesio (Mg), yodo (I), etc…
Estos elementos químicos se agrupan para formar unidades estructurales llamados AMINOÁCIDOS, a los cuales podríamos considerar como los "ladrillos de los edificios moleculares proteicos".
Se clasifican, de forma general, en Holoproteinas y Heteroproteinas según estén formadas respectivamente sólo por aminoácidos o bien por aminoácidos más otras moléculas o elementos adicionales no aminoacídicos.
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Son sustancias cristalinas, casi siempre de sabor dulce. Los aminoácidos se caracterizan por poseer un grupo carboxilo (-COOH) y un grupo amino (-NH2).
Los aminoácidos son las unidades elementales constitutivas de las moléculas denominadas Proteínas. Son pues, y en un muy elemental símil, los "ladrillos" con los cuales el organismo reconstituye permanentemente sus proteínas específicas consumidas por la sola acción de vivir. Los alimentos que ingerimos nos proveen proteínas. Pero tales proteínas no se absorben normalmente en tal constitución sino que, luego de su desdoblamiento ("hidrólisis" o rotura), causado por el proceso de digestión, atraviesan la pared intestinal en forma de aminoácidos y cadenas cortas de péptidos. Esas sustancias se incorporan inicialmente al torrente sanguíneo y, desde allí, son distribuidas hacia los tejidos que las necesitan para formar las proteínas, consumidas durante el ciclo vital.
Se sabe que de los 20 aminoácidos proteicos conocidos, 8 resultan indispensables (o esenciales) para la vida humana y 2 resultan "semiindispensables". Son estos 10 aminoácidos los que requieren ser incorporados al organismo en su cotidiana alimentación y, con más razón, en los momentos en que el organismo más los necesita: en la disfunción o enfermedad. Los aminoácidos esenciales más problemáticos son el triptófano, la lisina y la metionina. Es típica su carencia en poblaciones en las que los cereales o los tubérculos constituyen la base de la alimentación. Los déficit de aminoácidos esenciales afectan mucho más a los niños que a los adultos.
Hay que destacar que, si falta uno solo de ellos (aminoácido esenciales) no será posible sintetizar ninguna de las proteínas en la que sea requerido dicho aminoácido. Esto puede dar lugar a diferentes tipos de desnutrición, según cual sea el aminoácido limitante. http://www.aula21.net/Nutriweb/proteinas.htm – arriba#arriba
En esta imagen puede verse la fórmula de los 20 aminoácidos más importantes , en color negro la parte común, mientras que en color azul puede verse la parte variable, que da a los aminoácidos distinto comportamiento.
Fig 1. Estructura de los aminoacidos esenciales.
2.3 http://www.aula21.net/Nutriweb/proteinas.htm – arriba#arriba
Los péptidos y el enlace peptídico.
Los péptidos están formados por la unión de aminoácidos mediante un enlace peptídico. Es un enlace covalente que se establece entre el grupo carboxilo de un aminoácido y el grupo amino del siguiente, dando lugar al desprendimiento de una molécula de agua.
Así pues, para formar péptidos los aminoácidos se van enlazando entre sí formando cadenas de longitud y secuencia variable. Para denominar a estas cadenas se utilizan prefijos convencionales como:
Clasificación de los Péptidos que atiende al numero de aminoácidos enlazados.
Oligopeptidos | Menos de 10 aa |
Dipeptidos | 2 aa |
Tripeptidos | 3 aa |
Tetrapeptidos | 4 aa |
Polipéptidos o cadenas polipeptídicas.- si el n º de aminoácidos es mayor de 10.
Cada péptido o polipéptido se suele escribir, convencionalmente, de izquierda a derecha, empezando por el extremo N-terminal que posee un grupo amino libre y finalizando por el extremo C-terminal en el que se encuentra un grupo carboxilo libre, de tal manera que el eje o esqueleto del péptido, formado por una unidad de seis átomos (-NH-CH-CO-), es idéntico a todos ellos. Lo que varía de unos péptidos a otros, y por extensión, de unas proteínas a otras, es el número, la naturaleza y el orden o secuencia de sus aminoácidos.
Si la hidrólisis de una proteína produce únicamente aminoácidos, la proteína se denomina simple. Si, en cambio, produce otros compuestos orgánicos o inorgánicos, denominados grupo prostético, la proteína se llama conjugada. http://www.aula21.net/Nutriweb/proteinas.htm – arriba#arriba
2.4 ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS
La organización de una proteína viene definida por cuatro niveles estructurales denominados: estructura primaria, estructura secundaria, estructura terciaria y estructura cuaternaria. Cada una de estas estructuras informa de la disposición de la anterior en el espacio.
2.4.1. Estructura primaria
La estructura primaria es la secuencia de aminoácidos de la proteína. Nos indica qué aminoácidos componen la cadena polipeptídica y el orden en que dichos aminoácidos se encuentran. La función de una proteína depende de su secuencia y de la forma que ésta adopte.
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La estructura secundaria es la disposición de la secuencia de aminoácidos en el espacio. Los aminoácidos, a medida que van siendo enlazados durante la síntesis de proteínas y gracias a la capacidad de giro de sus enlaces, adquieren una disposición espacial estable, la estructura secundaria. http://www.aula21.net/Nutriweb/proteinas.htm – arriba#arriba
Existen dos tipos de estructura secundaria:
Esta estructura se forma al enrollarse helicoidalmente sobre sí misma la estructura primaria. Se debe a la formación de enlaces de hidrógeno entre el -C=O de un aminoácido y el -NH- del cuarto aminoácido que le sigue.
- La a(alfa)-hélice
- La conformación beta
A su vez la conformación beta o de hoja plegada, mantiene la estructura general del aminoácido pero a su vez prescinde de los enlaces puente hidrogeno que pueda hacer con otros aminoácidos parecidos o de semejante naturaleza, por ello da la impresión de ser un cuadernillo de hojas semidobladas y a ello debe su nombre.
Estas estructuras cumplen solamente la misión de organizar a las cadenas polipeptídicas estructuralmente entre ellas.
La estructura terciaria informa sobre la disposición de la estructura secundaria de un polipéptido al plegarse sobre sí misma originando una conformación globular.
En definitiva, es la estructura primaria la que determina cuál será la secundaria y por tanto la terciaria..
Esta conformación globular facilita la solubilidad en agua y así realizar funciones de transporte , enzimáticas , hormonales, etc.
Esta conformación globular se mantiene estable gracias a la existencia de enlaces entre los radicales R de los aminoácidos. Aparecen varios tipos de enlaces:
- El puente disulfuro entre los radicales de aminoácidos que tiene azufre.
- Los puentes de hidrógeno.
- Los puentes eléctricos.
- Las interacciones hifrófobas.
Esta estructura informa de la unión, mediante enlaces débiles (no covalentes) de varias cadenas polipeptídicas con estructura terciaria, para formar un complejo proteico. Cada una de estas cadenas polipeptídicas recibe el nombre de protómero.
El método más sencillo para sintetizar péptidos es la polimerizacion de un aminoácido.
El homopolímero resultante es una mezcla de péptidos que se diferencian en la longitud
de la cadena. Estos homopolímeros no se encuentran en la naturaleza, pero los de origen
sintético han servido para comprender algunas de las propiedades físicas y espectrales
de las proteínas.
Rxn.
H3N+-CH2-COO- H3N+-CH2-CO(NH-CH2-CO)n NH-CH2-COOEl
primer producto que resulta de la condensación de los aminoácidos es un dipéptido.
Los grupos amino y carboxilo terminales están situados ahora de tal manera que pueden
interactuar para formar una diamida cíclica de seis miembros. Se ha visto anteriormente
que las reacciones intramoleculares en que se forman anillos de cinco y seis miembros
son frecuentemente mucho mas rápidos que sus análogos intermoleculares. Asi, cuando
se calienta la glicina, se obtiene el dimero ciclico 2,5-dicetopiperazina.
Rxn.
Mas aún, la hidrólisis de uno de los enlaces amida en una 2,5-dicetopiperazina es uno de
los métodos para preparar dipéptidos sencillos.
Rxn.
El hallazgo de un método racional de síntesis de péptidos constituye un importante reto que solo se ha resuelto en las últimas décadas.
La síntesis de péptidos automatizada, se ha convertido asi, en una industria con vida propia, tratando de generar sustancias orgánicas con funciones específicas como hormonas y proteínas.
Debido a un cierto números de razones, la actividad de la investigación de la síntesis de péptidos ha sido intensa. Los péptidos sintetizados son de propio interés como sustancias biológicas activas, como materiales de examen para proba detalles de procesos bioquímicos, y modelos con los cuales podemos estudiar las propiedades químicas y físicas delas proteínas. En suma, la síntesis racional y total de péptidos ha sido necesaria para confirmar algunas de las estructuras deducidas de péptidos
sintetizados por naturaleza y fragmentos de proteínas. Finalmente, y de menos importancia, la síntesis racional de péptidos representa el ascenso a un nivel mayor de esa gran montaña que es la química. Los péptidos son las moléculas más largas que la química ha sintetizado con gran pureza y en forma homogénea, y esta síntesis no ha sido nada fácil teniendo en cuenta la polifuncionalidad de los componentes desde donde se construyen.
En el laboratorio como en la naturaleza, la síntesis de péptidos generalmente comienza con los aminoácidos. Ellos deben ser convertidos a polímeros de manera indirecta o condensados de manera gradual para formar especies moleculares especificas. Puesto que aminoácidos son moléculas di o polifuncionales, el acoplamiento directo del grupo carboxilo de uno con el grupo amino del otro es logrado mediante la protección de algunos de los grupos funcionales. Usualmente se realiza por ataque temporal de GRUPOS BLOQUEADORES O PROTECTORES que inhiben la reactividad de las
funciones que serán protegidas.
Estos GRUPOS BLOQUEADORES deberán cumplir las siguientes características:
- El grupo protector debe introducirse facilmente en la molecula.
- Debe proteger al grupo funcional en las condiciones de formación de la amida.
- Debe poder eliminarse en condiciones que dejen intacto al nuevo enlace amida
- creado.
Los grupos bloqueadores que son fácilmente introducidos y fáciles y selectivamente removidos son de necesidad imperiosa. Después que estos grupos protectores se introducen uno de los componentes que formara el enlace peptídico, usualmente el componente que provee el lado carboxílico, es previamente activado. El componente que contiene el grupo carboxilo activado y el componente que provee el grupo amino entonces se les permite reaccionar para formar el enlace peptídico o péptido, para acortar términos. Vale decir que la activación del grupo carboxilo y el acoplamiento son pasos secuenciales inmediatos.. Finalmente, los grupos bloqueadores son removidos. El esquema general se indica en la Figura 1, donde los pasos individuales son discutidos mas adelante.
No muchos años atrás, muchos grupos protectores, activadores y procesos de acoplamiento han sido desarrollados. En este trabajo solo consideraremos aquellos que sean de provecho en la síntesis de péptidos de importancia superior.
Figura 1: ESQUEMA DE LA SINTESIS DE PEPTIDOS.
PROTECCIÓN DE GRUPOS AMINOS.
Para el acoplamiento directo, el grupo -amino del componente carboxílico debe ser restringido de reaccionar con el grupo carboxilo activo (evitando asi la dimerizacion y polimerización peptídica consecuente). Esto se realiza mediante la adición de sustituyentes que reducen la nucleofilidad de la amina, usualmente mediante la reducción de la disponibilidad del par electrónico libre. La basicidad del grupo amino se convierte así en una dificultad adicional.
La acilación de la amina provee una protección efectiva, pero los grupos acilos comunes, por ejemplo, acetilo o benzoílo, no servirán a este propósito. Un grupo Nacetilo o N-benzoilo no puede ser removidos sin ruptura del enlace peptídico que se intentara formar. Los grupos protectores usuales han sido los sustituyentes alcoxicarbonilos.
El grupo benciloxycarbonilo.
C6H5-CH2-O-CO
En 1932, Max Bergmann y Leonidas Zervas presentaron el grupo protector benciloxycarbonilo (o carbobenciloxy). Este invento modernizó la síntesis de péptidos, el benciloxicarbonilo es aun la primera opción para la protección o recubrimiento del nitrógeno del grupo amino en la síntesis de péptidos. El cloruro de benciloxi carbonilo es preparado mediante reacción del fosgeno con alcohol bencilico [Eq. (1)].
C6H5-CH2-OH + Cl-CO-Cl C6H5-CH2-O-CO-Cl + HCl [1]
Este cloruro de acilo reacciona con aminas o aminoacidos para formar el correspondiente uretano, derivados de N-benciloxicarbonilos, en gran rendimiento [Eq (2)].
Los derivados de N-benciloxicarbonilos, al igual que otras amidas, no reaccionaran fácilmente con grupos carboxilos activados, pero a diferencia de otras, deberán ser convertidas al grupo amino original bajo condiciones no hidrolíticas.
C6H5-CH2-OOC-Cl + H2N-R + OH- C6H5-CH2-OOC-NHR + Cl- [2]
El enlace éster bencilico de un grupo N-benciloxicarbonilo es estable a condiciones alcalinas relativamente leves en que saponificamos el éster de metil o etil del péptido, pero experimenta una catálisis ácida con ruptura del enlace alquil-oxigeno. El ataque ácido es facilitada por la presencia de un agente nucleofílico que debe atacar el átomo de carbono bencílico. La eliminación práctica de un grupo N-benciloxicarbonilo se lleva a cabo mediante tratamiento con ácido bromhidrico 2N en algún solvente orgánico (ácido acético, nitrometano, ácido trifluoroacético) a temperatura ambiente [Eq(3)]. La división completa requiere solo minutos.
Una vez que el enlace bencil-oxigeno ha sido roto, el átomo de nitrógeno se encuentra aun envuelto en una estructura ácido carbamica. Los ácidos carbamicos, sin embargo, tienen una existencia transitoria en soluciones ácidas; se descarboxilan inmediatamente para formar dióxido de carbono y una sal de amonio [Eq(4)].
La sal de amonio debe precipitar por adicion de eter. Los enlaces peptidicos y la mayoria de los grupos funcionales de los aminoacidos son estables en estas condiciones, aun cuando no todos los otros grupos protectores sobreviven a ellas.
[HOOC-NH-R] 0=C=0 + H2N-R H+H3N+ -R [4]
Un método alternativo para remover los grupos benciloxicarbonilos utiliza una diferente peculiaridad de ésteres y éteres de bencilo. La desunion bencil-oxigeno debe ser producida por reducción, con la formación de tolueno. Este proceso es conocido como hidrogenolisis [Eq(5)]
C6H5-CH2-OOC-NH-R + 2[H] C6H5-CH3 + [HOOC-NH-R] [5]
La hidrogenolísis de los derivados de benciloxicarbonilo es mas conveniente mediante el bombeo de hidrogeno en suspensión con un catalizador de paladio en una solucion del derivado. El paladio, en comparación con el platino, es usado como catalizador ya que presenta una menor tendencia para hidrogenar anillos aromáticos. Si la contaminación del catalizador hace que el método sea impracticable en el caso de la presencia de azufre de ciertos aminoácidos (cisteína y metionina), la hidrogenolísis se llevará a cabo con sodio sumergido en amoniaco.
La química orgánica tiene en el grupo benciloxicarbonil un bloqueador que es fácilmente introducido en los aminoácidos (o sus ésteres) y es eliminado de los péptidos bajo condiciones que no son nocivas para el enlace peptídico. El suceso de este grupo protector ha conducido al desarrollo de un buen numero de versiones modificadas. La sustitución del p-Nitrobenciloxicarbonil rinde sustancias que son mas fácilmente cristalizables que los mismo derivados de benciloxicarbonilo. El grupo p-nitrobenciloxicarbonilo es dificilmente atacado por las soluciones de acido bromhidrico.
En contraste, el grupo p-metoxibenciloxicarbonilo son eliminados o removidos a 0oC por el acido trifluoroacetico, un conjunto de condiciones a las cuales el grupo benciloxicarbonilo es estable. Los grupos benciloxicarbonilos azo sustituidos han sido tambie utilizados ; estos dan derivados coloreados, los cuales son facilmente detectados mediante cromatografía.
El grupo t-butoxycarbonilo.
(CH3)3C-O-CO
Un segundo grupo bloqueador alcoxicarbonilo, el cual, cuando es usado con el benciloxicarbonilo, provee una protección diferente de grupos funcionales, hablamos del grupo t-butoxicarbonil. Este grupo debe, al igual que el grupo benciloxicarbonilo, ser removido mediante catálisis acida por ruptura de u enlace alquil-oxigeno, pero solo se usara a condiciones que no afecten el enlace bencil-oxigeno. El grupo tbutoxicarbonilo es eliminado a 20oC en una hora o menos bajo tratamiento con acido
trifluoroacetico anhidro o acido clorhidrico 2N [Eq(6)].
El grupo t-butoxicarbonilo no es afectado por la hidrogenacion, y, como todos los esteres terciarios es extremadamente fuerte a la hidrólisis basica.
(CH3)3C-O-CO-NH-R H+[(CH3)3C+] + [HO-CO-NH-R]
[(CH3)3C+] + [HO-CO-NH-R] H+(CH3)2 C=CH2 + CO2 + H3N+ -R [6]
Así, en la misma molécula, los grupos protegidos por el grupo t-butoxicarbonilo deberán ser desbloqueados sin liberar aquellos protegidos por el grupo benciloxicarbonilo; este se produce por leve tratamiento con acido. El resultado opuesto, desbloquear grupos protegidos por el grupo benciloxicarbonilo mientras salen estos protegidos por t-butoxicarbonilo, se logra por hidrogenación. Esta suerte de versatilidad es mas buscada en la síntesis de algún complejo.
Un grupo t-butoxicarbonilo no puede ser usado mediante su correspondiente cloruro de acilo, desde que es muy inestable [Eq(7)], se usara en todo caso una azida acida [Eq(8)]. La azida reacciona con aminas o aminoacidos in agua o solventes organicos, en la presencia de bases débiles.
(CH3)3C-OOC-Cl 10º(CH3)2C=CH2 + HCl + CO2 [7]
(CH3)3C-OOC-N3 + H2N-R (CH3)3C-OOC-NH-R + HN3 [8]
Las t-butoxicarbonil hidrazidas, una via estable para la preparación de la azida necesaria, es preparada en una secuencia de dos pasos. [Eq(9),(10)].
Esta es convertida a azida reactiva mediante el tratamiento con acido nitroso [Eq(11)]
(CH3)3C-OH + Cl-CO-S-C6H5 PYRIDINA(CH3)3C-O-CO-S-C6H5 [9]
(CH3)3C-O-CO-S-C6H5 + NH2-NH2 (CH3)3C-O-CO-NHNH2 + HS-C6H5 [10]
(CH3)3C-O-CO-NHNH2 + HONO (CH3)3C-O-CO-N3 [11]
El grupo toluenosulfonilo.
CH3-C6H5-SO2
Se produce toluenosulfonamida cuando reacciona una amina con el cloruro de ptoluenosulfonilo en presencia de base [Eq(12)].
CH3-C6H5-SO2-Cl + H2N-R + OH- CH3-C6H5-SO2-NHR + Cl- + H20 [12]
Las toluenosulfonamidas no reaccionan con agentes acilantes y son estables a casi todas las condiciones que puedan ser encontradas en la sintesis de peptidos. Ellos son fomrados mediante el tratamiento con sodio y amonio liquido, cuyos efectos reductivos rompen el enlace S-N [Eq(13)]
CH3-C6H5-SO2-NHR + 2[H] Na/NH3CH3-C6H5-SO2- +Na + H2N-R [13]
El grupo Trifenilmetilo (Tritilo).
(C6H5)3C-Cl
El cloruro de trifenilmetilo (tritilcloruro) reacciona con aminoacidos y esteres en solventes organicos, en presencia de base, para formar esteres de N-trifenilmetil (Ntritil) aminoacidos [Eq(14)]. Aunque bien estos derivados son aun algo basicos, ellos estan estericamente impedidos de reaccionar con derivados de carboxilos activados. Los esteres N-tritil--aminoacidos de metilo (o etilo) deben ser saponificados para producir el N-tritilo-aminoacido, pero la saponificacion es lenta ,
(C6H5)3C-Cl + H2N-R (C6H5)3C-NH-R + Cl- + H+ [14]
ya que los sustituyentes tritilos voluminosos interfieren con las reacciones tanto del grupo carboxilo como las del grupo amino. Este efecto esterico es una desventaja e el uso de N-tritilo--aminoacido activado como componente carboxilico en el acoplamiento peptidico; sin embargo, el residuo tritilo puede ser usado en la protección de otros grupos a excepcion de -amino.
El grupo tritilo no se puede eliminar mediante alcalis, pero a causa de que la estabilidad de los cationes trifenilmetilos resultantes, un intermediario en la reaccion acidocatalizador, es en extremo inestable para diluir acidos y es eliminado por calentamiento por pocos minutos con dilucion acuosa de acido acetico. [Eq(15)]
(C6H5)3C-NHR + H+ [((C6H5)3C]+ + N2HR H2O (C6H5)3C-OH [15]
Otros grupos N-protectores.
En suma a los cuatro grupos descritos anterioremente muchos otros han sido utilizados ocasionalmente en la sisntesis de peptidos o para la proteccion de grupos amino en otras sintesis. Tres de ellos deben ser mencionados. Las aminas y aminoacidos pueden ser convertidos a derivados de N-formilo mediante el uso de una mezcla de ácido fórmico y anhidrido acético. La reacción probablemente procede a través de la mezcla anhidrido acético-fórmico [Eqs(16), (17)].
CH3-CO-O-CO-CH3 + HCOOH CH3-CO-O-CO-H + CH3COOH [16]
CH3-CO-O-CO-H + H2N-R CH3COOH + H-CO-NHR [17]
El grupo formilo es fácilmente eliminado por tratamiento con HCl 1N en metanol a temperatura ambiente.
La reaccion de una amina con trifluorotiolacetato de etilo [Eq. (18)] resulta en la formación de un derivado de N-trifluoroacetilo.
CF3-CO-S-Et + H2N-R CF3-CO-NHR + Et-SH [18]
Las trifluoroacetamidas son de las pocas amidas que son fácilmente hidrolizadas por base. El hidróxido de sodio 1N a temperatura ambiente sera suficiente.
Los aminoacidos pueden ser convertidos a derivados de N-ftaloil mediante fusión con Anh. Ftálico [Eq.(19)].
Hay peligro que pueda ocurrir la racemización del átomo de -carbono óptimamente activo en este proceso, se han diseñado otros metodos más suaves para introducir el grupo ftaloil. En contraste con otros N-acil--aminoacidos, los derivados de N-ftaloil pueden ser convertidos a cloruros de acilo estables por medio de ácido clorhídrico de tal manera que puedan ser utilizados como componentes carboxílicos activados en el acoplamiento de péptidos. Un grupo de condiciones para eliminar el grupo bloqueador ftaloil sin afectar los enlaces peptídicos, involucra el tratamiento con hidracina [Eq.(20)]; desafortunamdamente este puede derivar en una indeseable hidrazinolisis (esto es formación de hidrazida) de ésteres que pueden estar presentes.
PROTECCION DE FUNCIONES CARBOXILICAS.
El acoplamiento de péptidos puede ser llevado a cabo satisfactoriamente sin la protección del grupo carboxilo o del componente amino solo si los pasos de activación y de acoplamiento no son combinados. Si los dos pasos son combinados en una sola operación, los grupos carboxilos de ambos componentes competirán por el agente activante y se producira una mezcla de productos acoplados.
Esteres de metil y etil
La formación de ésteres es la forma mas común de protección de grupos carboxilo. Para ello se realiza la metil y etil esterificación de aminoaciodos con los alcoholes respectivos. Cuando se desee estos grupos son eliminados por saponificación, utilizando mezclas de solventes orgánicos y alcalis acuosos, (por ejemplo: agua-dioxano o aguapiridina) a temperatura ambiente. La ruptura usualmente requiere de minutos a horas.
Sin embargo, el ataque a los enlaces peptídicos puede ocurrir en algunos casos, y los rendimientos pueden no ser satisfactorios siempre.
Los ésteres de etilo o metilo son usados como grupos protectores carboxílicos cuando se desea eventualmente convertir el grupo carboxilo final el péptido en una acil-azida (la discusión de este metodo de acoplamiento se discutirá más adelante).
Esteres de p-nitrobencil.
Los ésteres bencílicos, los cuales son convertidos a ácidos carboxílicos libres, mediante el mismo tratamiento que elimina los grupos N-benciloxicarbonilo, son generalmente formados por destilación azeotrópica de agua desde una mezcla de alcohol bencílico y el aminoácido en la presencia de un acido catalizador como puede ser benceno o ácido toluenosulfónico.
Los ésteres p-nitroglicil o bencilos pueden ser preparados por una esterificación directa usando alcohol p-nitrobencilico en condiciones ácidas, pero tambien son convenientemente preparados mediante reacción de bromuro de p-nitrobencilo con la sal de plata de un aminoácido N-protegido [Eq.(21)].
La eliminación selectiva de los grupos de N-benciloxicarbonilo desde los péptidos o ésteres nitrobencilo de aminoácidos se lleva a cabo a traves de un tratamiento con bromuro de hidrógeno en ácido acético.[Eq.(22)]
Esteres de t-butil.
Los ésteres de t-butil no son hidrolizados por álcalis o atacados por otros agentes nucleofílicos pero pueden ser eliminados cuando sea necesario por los mismo agentes que eliminan los grupos t-butoxi carbonilo. El ester de t-butilo es introducido por esterificación directa de un aminoácido y un N-acilaminoacido, y el isobutileno y el catalizador ácido sulfúrico usando cloruro de metileno como solvente, sirve para este propósito [Eq(23)]. Se puede utilizar una reacción de trans esterificación con acetato de t-butilo [Eq.(24)]
R-COOH + (CH3)2C=CH2 H+R-CO-C(CH3)2 [23]
R-COOH + CH3-CO-O-C(CH3)3 H+R-CO-C(CH3)3 + CH3COOH [24]
PROTECCION DE CADENAS LATERALES:
GRUPOS GUANIDINO, AMINO E IMIDAZOL.
Tres aminoácidos poseen cadenas laterales sumamente básicas: La histidina contiene un grupo imidazol; la lisina un grupo -amino; y la arginina un grupo -guanidino. La cadena lateral de histidina es algunas veces protegida como derivado de N(im)-bencilo (im=imidazol), la cual puede ser unida mediante reacción con sodio en amoniaco líquido; otras veces no es protegida. Las cadenas laterales de lisina y arginina deben estar siempre protegidas si se desea prevenir su participación en las reacciones de acoplamiento.
En el caso de la lisina, todos los grupos protectores discutidos antes para la protección de grupos aminos terminales, son utilizables para la protección de esta cadena lateral. Se utiliza particularmente la combinación de grupos (Por ej: [E2], [E3]) las cuales permiten la desprotección selectiva de grupos aminoterminales, mientras el grupo N-protector es dejado intacto.
La reaccion selectiva del grupo -amino durante la fase de protección puede ser llevada a cabo mediante el uso de un complejo de cobre de aminoácido [E4]; y subsecuentemente puede ser eliminado el cobre, por ejemplo, mediante reduccion con H2S o mediante el uso de un agente secuestrador o enmascarante. Este método es de aplicación general para el bloqueo de grupos -amino y -carboxilo durante la introducción de funciones dentro de las cadenas.
El grupo guanidino de la arginina se distingue de los demás a causa de su pronunciada basicidad (pKa12,5) el cual es tal que el grupo permanece completamente protonado bajo condiciones en las cuales el grupo -amino (pK9,25) se dispone a actuar como un nucleófilo. De esta manera, la cadena lateral del residuo argininio puede ser protegida como una sal, por ejemplo, como un hidrobromuro y usada en la síntesis de péptidos a pH9 sin la complicación de reacciones laterales. El grupo guanidino es nucleofílico y puede también ser bloqueado mediante grupos de enlace covalente o de protectores de tipo amino. Se usa en particular N-benciloxicarbonilo-N-tosilarginino
[E5] en esta forma.
Uno de los metodos más populares para el bloqueo del grupo guanidino es el del nitrato.
Se han descrito ya muchos derivados de nitro arginina. El grupo nitro es unido mediante catálisis o reducción electrolítica, pero los detalles de esta reacción no son totalmente comprensibles. Aunque bien, se sabe que el ataque es usualmente exitoso cuando se emplea una cantidad relativamente pequeña de péptidos, los productos pueden ser formados por reacciones laterales del intermediario N-nitrosoguanidino; con péptidos mas grandes es severamente dificultoso tal procedimiento.
Se utiliza tambien fluoruro de hidrogeno anhidro para romper o clivar el grupo nitroguanidino y aunque el mecanismo de esta reacción no es entendido, este debe representar un avance.
PROTECCION DE CADENAS LATERALES
Grupos Carboxílicos.
Sendas protecciones de los grupos carboxilo de los acidos glutámico y aspártico son necesarias si estos residuos van ha ser incorporados dentro de péptidos.
La esterificación directa del ácido y del catalizador del ácido aspártico o del ácido glutámico mediante alcohol metílico, etílico o bencílico, puede ser echa para rendir el respectivo diester. Si la esterificación no se maneja hasta completar la reacción, solo se obtendrá el ester de la cadena lateral [Eq(27)]. La esterificación acido-catalizador, la cual requiere la protonación del grupo carboxilo que va ha ser esterificado, procede mas rápidamente si el carboxilo además de la carga positiva alrededor lleva al lado el grupo -amino.
No se desea la protección de las cadenas carboxílicas laterales como ésteres de metilo o etilo debido a que los rearreglos están aptos a ocurrir durante la hidrólisis alcalina. Se requiere regenerar el grupo carboxilo libre. Estos rearreglos los cuales proceden a través de intermediarios cíclicos, resultan en convertir los péptidos involucrando el - carboxilo a productos en las cuales las cadenas laterales carboxílicas son parte del enlace carboxílico fundamental [Eq.(28)].
Los ésteres -bencílico de ac. glutámico y ac. aspártico son preparados a partir de los correspondientes ésteres dibencílicos mediante control cuidadoso del ataque utilizando yoduro de hidrógeno en ac. acético. La ruptura ácida de los ésteres de bencilo, los cuales requieren la protonacion del oxigeno estérico [cf. Eq. (3)], ocurre mas rápido que el lugar desde donde salió el ion amonio.
El medio ester-bencílico del ac. aspártico y el ac. glutámico puede ser convertido a un ester bencil-t-butil mediante tratamiento con isobutileno y un ac. catalizador. De esta manera seran convertidos a el correspondiente medio t-butilico por saponificiación o hidrogenolisis [Eq.(29)]
Grupos sulfhidrilo.
El grupo sulfhidrilo de la cisteina debe ser protegido todas las veces durante la síntesis de péptidos. Algunos iones mercáptidos estan presentes cuando existe un grupo mercapto desprotegido. (el pKa de un tiol alifático es cerca de 10). Los iones mercáptidos son poderosos nucleófilos capaces de competir satisfactoriamente, siempre a bajas conentraciones, para reacciones con grupos carboxilos activados. Mas importante, sin embargo, es el echo, de que los mercaptanos por medio de los iones
mercáptidos son fácilmente oxidables por aire u otros agentes para formar disulfuros [Eq. (30)].
2RSH + [O] RS-SR + H2O [30]
La cisteina es el péptido mas facilmente manejable en la síntesis como S-bencil cisterna preparado mediante tratamiento de cisteina, en la forma de una sal de sodio en amoniaco líquido , con cloruro de bencilo [Eq. (31)].
Cuando se desea remover el grupo protector, se utiliza la hidrogenólisis por sodio en amonio líquido. A causa de que este tratamiento frecuentemente resulta en bajos rendimientos cuando se aplica a péptidos grandes, los grupos S-benciloxi carbonilo y el S-tritil han sido ocasionalmente sustituidos por el S-bencil.
Otros Grupos
El hidroxilo fenólico de la tirosina y el hidroxilo alcohólico de la serina y treonina no requiere normalmente protección durante la síntesis de péptidos. Ellos pueden sin embargo ser protegidos como éteres de bencilo y derivados acetilos. La o-acetil serina es preparada mediante saturación de una suspensión de serina en ácido acético glacial con cloruro de hidrógeno, una inversión de la preparación del éster carboxílico del -aminoácido.
ACTIVACION Y PROCEDIMIENTOS DE ACOPLAMIENTO
De la mezcla de una amina alifática con un ácido carboxílico a temperatura ambiente resulta solo la formación de una sal. Para convertir esta sal en una amida [Eq. (35)], requiere temperaturas muy altas como para que sobrevivan la mayoría de péptidos. Por lo tanto, la formación de un enlace peptídico es generalmente llevado a cabo mediante la conversión de un componente carboxílico a un derivado mas reactivo que es el acilo, algunos de los cuales reaccionan con el componente amino en condiciones más suaves.
R-COOH + H2N-R' R-COO- +H3N-R' R-CO-NH-R' + H2O [35]
El mecanismo en detalle de la reacción entre aminas y derivados acílicos depende de la naturaleza de la amina y el grupo originalmente atacado por el grupo acilo, que lo deja cuando la amida es formada. Cuando los reactantes normalmente se encuentran en el acoplamiento de péptidos, el ataque nucleofílico inicial mediante la amina conduce a una especie intermedia que puede revertir a los materiales iniciales o descomponer a los productos como se indica en [Eq(36)]. El mas electronegativo es el grupo saliente [-X] (que es el -X menos básico o el H-X mas ácido), lo mas favorable, termodinamicamente hablando, probablemente sera la formación de la amida. La reacción en general procede relativamente lenta si el grupo -X es un grupo alcoxi como en un éster y en general procederá mas rápidamente si el grupo -X es un haluro como en los halogenuros de hidrógeno. Sin embargo la Eq [36] consiste en dos equilibrios sucesivos, donde las reacciones que proceden a la derecha son altamente favorecidas bajo condiciones en que usualmente la formación de una amida es irreversible.
La formación de una amida vía ácido clorhídrico fue usada en la síntesis de péptidos en sus inicios: Un componente carboxílico N-protegido fue convertido a su cloruro de acilo mediante tratamiento con cloruro de tionilo o pentacloruro de fósforo, y su derivado activado se le permite reaccionar con el componente amino. La forma de la protección del nitrógeno amínico que puede usarse con este método es limitado, sin embargo, en general los haluros de N-acilo--aminoacílicos no retienen la actividad óptica del -carbono central asimétrico. Se puede preparar a bajas temperaturas cloruros de Nbenciloxicarbonilaminoácidos opticamente estables, pero a temperatura ambiente ellos experimentan la descomposición a anhidrido de N-carboxiaminoácidos y son por lo tanto de uso inconveniente.
Cuatro procedimientos de activacion carboxilica y acoplamiento se describen en las siguientes lineas, han sido ampliamente aceptados para la síntesis de péptidos complejos. Su aceptación se basa; primero, en el hecho de que ellos pueden ser usados con una minima pérdida de la pureza óptica del componente carboxílico y; segundo, sobre un conveniente balance libre de reacciones laterales, y práctico rendimiento.
METODO DE LA MEZCLA DE ANHIDRIDOS.
La reacción de un anhidrido carboxílico con una amina es un método común de Nacilación, pero usar el anhidrido simétrico de un aminoácido N-protegido puede ser destructivo para ese componente, desde que solo la mitad podría poveer de un grupo acilo. Sin embargo, la mezcla de anhidridos las cuales reaccionan con aminas solo si el componente carbonil del aminoacido N-protegido, puede ser usado en vez.
R-CO-O- + Cl-CO-OR' R-CO-O-CO-OR' + Cl- [37]
Para la sintesis de peptidos, se utiliza la mezcla de anhidridos del componente carboxilico con acido etil o isobutil carbonico. Estos son preparados mediante un procedimiento estandar para la mezcla de anhidridos: La reaccion de una sal de un componente con un haluro acilico del otro. Usualmente se usa la sal de trietilamonio del componente carboxilico del peptido. [Eq. (37)]. La sintesis de un anhidrido se lleva a cabo con un solvente no polar, si es posible, alrededor de -10oC. La formación del
anhidrido se completa en minutos. El componente aminico se adiciona inmediatamente a la mezcla reactiva, y el acoplamiento procede a esta baja temperatura [Eq.(38)]
R-CO-O-CO-O-R' + R''-NH2 R-CO-NHR'' + CO2 + R'-OH [38]
El rendimiento se encuentra en el rango de 40 a 95 por ciento. Una reacción lateral, evitada mediante el uso de bajas temperaturas (arrriba de -5ºC), es la descomposición de la mezcla de anhidrido para formar un éster.[ Eq.(39)]
R-CO-O-CO-OR' R-CO-OR' + CO2 [39]
La mezcla de anhidridos a excepcion del carbonico han sido utilizados en elacoplamiento de peptidos. Estos incluyen a aquellos formados con derivados de acido fosforico y sulfurico, tambien como acidos carboxilicos con impedimento esterico tales como el Pivalico.
METODO DE LAS ACIL AZIDAS.
Una reaccion de acoplamiento de peptidos que ha resistido una gran cantidsad de tests, y fue de echo, una de las primeras en ser descubierta (por Curtius, en 1902), es la reaccion de un componente amino con una acil azida [Eq. (40)]. Este es el unico metodo de sisntesis de peptidos que no deja detectar la racemizacion de un componente carboxilico a pesar de su naturaleza.
R-CO-N3 + H2N-R' R-CO-NHR' + HN3 [40]
Sin embargo, es un procedimiento complicado del cual siempre se obtienen bajos rendimientos, es aun una de las mas amplias tecnicas de acoplamiento aun usadas.
Para formar una azil azida, un componente de un ester de metil o etil carboxilico es primeramente tratado con hidrazida [Eq.(41)].
R-CO-Ome + H2N-NH2 R-CO-NH-NH2 + Me-OH [41]
La acilhidrazina a ser formada es usualmente cristalina y puede ser purificada por recristalizacion. Es entonces tratada con acido nitrico en solucion acuosa, o en un medio anhidro medianamente acido con un nitrito alquilico o un cloruro de nitrosilo para producir la acil azida [Eq.(42)].
R-CO-NH-NH2 + HONO [ R-CO-N=N+=N- R-CO-N–N+N ] [42]
El aislamiento y purificación de la azida se basa en su solubilidad en solventes orgánicos y su insolubilidad en agua.
Todos los mecanismo de una acil azida pueden ocurrir a bajas temperaturas (debajo de los 5oC) para suprimir el rearreglo Curtius. Sin embargo, el rearreglo Curtius [Eq.(43)] a isocianatos y sus derivados es una herramienta muy utilizada en otras circunstancias, su ocurrencia en síntesis de péptidos no solo reduce los rendimientos de la formación de péptidos si no que también dificulta la purificación del producto.
Las acil azidas se acoplan con componentes aminos en solventes orgánicos a 5oc o por debajo de esta temperatura. Todos los intervalos de su rendimiento están entre 30 y 70%.
METODO DE LAS CARBODIIMIDAS.
N,N'-dialquilcarbodiimidas, disponibles mediante deshidratacion o destiolacion de las ureas o tioureas respectivamente. [Eqs. (44), (45)] , se utilizan como agentes acoplantes de peptidos en un solo paso.
R-NH-CO-NH-R + Ph-SO2-Cl + Et3N R-N=C=N-R + Ph-SO3H + [EtNH]+Cl- [44]
R-NH-CS-NH-R + HgO R-N=C=N-R + HgS + H2O [45]
La N.N'-diciclohexilcarbodiimida fue inicialmente explotada para la formación de derivados de acido pirofosforico. [Eq.(46)], pero su utilidad en la sintesis de derivados carboxilicos fue prontamente establecida.
2 (RO)2P(O)OH + C6H11N=C=NC6H11 (RO)2P(O)OP(O)(OR)2 + C6H11N-CONC6H11
[46]
Cuando a una dialquilcarbodiimida se le permite reaccionar con un acido carboxilico se forma inicialmente una orto aciluea [Eq.(47)]. La ortoacil urea reacciona facilmente con nucleofilos.
Si una amina esta resente se formara una amida [Eq(48)].Si ningun otro nucleofilo esta presente o si la reaccion con los presentes es muy lenta o muy impedida, el reactivo intermediario experimenta un reareglo a una N-acilurea que es mucho mas estable, la cual es solo ligeramente suceptible a reaccionar con nucleofilos. [Eq. (49)].
La acilacion inducida por una dialquilcarbodiimida no es restrigida a aminas; los fenoles son covertidos a esteres fenilicos, y si existe un exceso de acido carboxilico como unico reactante disponible se formaran anhidridos carboxilicos.
LA N,N'-diciclohexilcarbodiimida es el agente mas facilmente disponible para la reaccion antes descrita. La manipulacion inicial requiere para su uso en el acoplamiento de peptidos es extremadamente simple: los componentes amino y carboxilo son mezclados en una concentracion tan alta como sea posible; la solucion es enfriada a OoC- y la carbodiimida es adicionada. La presencia de agua no es una interferencia seria con el acoplamiento peptidico inducido por la carbodiimida, y por consiguiente se pueden usar solventes acuosos.
Ocasionalmente, la separacion de la diciclohexil urea, el producto de hidratacion de la carbodiimida, desde el producto peptidico es dificultosa. Para conocer esta dificultad, las dialquil carbodiimidas que rinden ureas solubles en agua han sido utilizadas, dispuestas. Un ejemplo es la hidrocloruro de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida:
Formula:
[Me2NH(CH2)3-N=C=N-Et]+Cl-
METODO DE LOS ESTERES ACTIVOS.
La aminolisis de esteres alquilicos simples son usualmente lentas. Esteres fenilcos son mas reactivos por que los iones fenolato siendo menos basicos que los iones alcoxidos (ellos son las bases conjugadas de ac. fuertes) son mejores grupos salientes [Ver Eq.(36) y su discusion].
La acidez de un fenol y dee esta manera la reactividad de sus esteres para con aminas y otros nucleofilos es marcadamente incrementada mediante la sustitucion de grupos electro-atrayentes en los anilos aromaticos. Ac ausa de esto, esteres de pentaclorofenilo han sido introducidos y el p-nitrofenilester es de uso correinte y extensivo como activador de componentes carboxilicos en la sintesis de peptidos. Los p-nitrofenilesteres son preparados mediante reaccion de un componente
carboxilico con el p-nitrofenol usando N,N'-diciclohexilcarbodiimida como el agente acoplante [Eq. (50)].
El ester p-nitrofenil de benciloxicarbonilaminoacido es un material cristalino, el cual, en contraste con otros derivados carboxil activados pueden ser almacenados (en la oscuridad) en alguna repisa del laboratorio. Para el acoplamiento, el ester de nitrofenilo y el componente amino son mezclados en un solvente no hidroxilico y almacenados a temperatura ambiente [Eq.(51)].
Los rendimientos cubiertos de los productos peptidicos son usualmente altos, casi siempre cuantitativos.
El metodo del ester nitrofenilico es especialmente usado en la construccion de cadenas peptidicas mediante adicion gradual de un residuo aminoacidico simplea al amino terminal de una cadena creciente. Cuando este metodo es usado, el paso el cual podría resultar en pobres rendimientos, seria la formación del ester activo, la cual ocurre a los mismos niveles relativamente económicos del benciloxicarbonil-aminoácido.
RACEMIZACION.
Una sintesis de peptidos satisfactoria debe proceder sin afectar la configuración de algunos de los centros asimetricos de los componentes. En el trabajo de peptidos, la formación de mezclas diasteromericas es al menos tan indeseable como la formación de enlaces covalentes entre los átomos equivocados. En la síntesis de péptidos fisiologicamente activos; por ejemplo, es importante conocer que alguna propiedad biologica de la molecula cuya sintesis se busca directamente, y no señal de algún diasterómero áltamente activo. Desafortunadamente, es frecuentemente dificultoso
separar péptidos que difieren solo de su configuración. Evitar la racemización de centros opticamente activos es, sin embargo, una de las mayores importancias en el planeamiento de sintesis de peptidos. Normalmente, el centro asimetrico corre peligro de perder la actividad óptica solo durante la formación del enlace peptidico, es decir durante la formación del enlace -carbono adyacente al grupo carboxilo activado. La racemización de este centro ocurre en gran parte a través de la formación de un intermediario 5-oxazolona (azlactona), el cual puede ser sintetizado, con frecuencia reversiblemente, desde algún derivado acilo de un N-acil-aminoácido que es suficientemente electrofílico para experimentar el ataque nucleofílico externo ilustrado en [Eq(52)]
Las 5-oxazolonas forman aniones estabilizados por resonancia en los cuales el centro asimetrico inicial toma un arreglo de enlaces trigonales. Alguna base debil presente en una solucion conteniendo la oxazolona, aún el solvente mismo, puede catalizar la pérdida de la actividad óptica via el anión oxazolona, aún a su vez, considerando que la formación del anion no se ve favorecida hacia el equilibrio. [Eq(53)].
La formación del equilibrio de la oxazolona no necesita ser extensiva para efectuar la racemizacion, pero la ciclizacion de Eq (52). No interfiere en el acoplamiento de peptidos, por que las 5-oxazolonas por si mismo reaccionan con las aminas para dar amidas [Eq.(54)].
La evidencia del mecanismo de la oxazolona para la racemizacion incluye la identificacion espectrofotometrica de oxazolonas en soluciones de esteres de pnitrofenil de acilamino tambien como el estudio cinetico de cantidades de racemizacvion y apertura de anillos de oxazolonas opticamente activas.
La racemizacion de un derivado carboxilo opticamente activo se ha observado tambIen que ocurre en ciscunstancias donde la formación de la azlactona es difícil o imposible.
En estos casos, la ruta probable involucra la ionizacion directa de un proton de el -carbono de el derivado de aminoacido. Este grupo C-H es menos acido que el correspondiente grupo en una 5-oxazolona, pero su anion es aún estabilizado por resonancia y similarmente incapaz de retener asimetría:
-CONH-C: (R)- CO-X -CONH-C(R)=CO-X
Atendiendo a los factores que afectan la racemizacion, el proceso de acoplamiento de peptidos y la sintesis de peptidos puede ser diseniada de tal manera que la perdida de la actividad optica sea minima. Los factores observados son los siguientes:
1.- Cuidado en el metodo de activacion y acoplamiento, la racemizacion es minimizada mediante la utilizacion de lso solvente menos polares posibles.
2.- La racemizacion es favorecida por la presencia de alguna base sobre y por encima de la cantidad necesaria correspondiente al grupo amino de el segundo componente.
3.- La racemizacion es favorecida por altas temperaturas.
4.- Los derivados de Prolina no son facilmente racemizados. [Un derivado de N-acil prolina el cual carece de un grupo N-H no puede ciclarse por el mecanismo de la Eq(3-52)].
5.- Los derivados de N-ftaloil y N-toluenosulfonil no son facilmente racemizados. (Esto, por supuesto, no pueden formar 5-oxazolonas).
6.- Los derivados de N-alcoxicarbonil aminoacidos no se racemizan en la activación.
(Se concibe que estos no forman facilmente 5-Oxazolonas, sin embargo, un proceso análogo a la ciclacion permite la formación de N-carboxianhidridos a partir de los halogenuros de benciloxicarbonilaminoacilos.
7.- Las N-acil--aminoacil azidas no se racemizan. La razón aun no es clara.
Esquema de una Síntesis Clásica : El Glutation.
El Glutation ha sido sintetizado en mas de una docena de formas diferentes. La mayoría de las rutas se inician con la formación de un derivado de cisteinglicina protegido adecuadamente al cual se le acopla subsecuentemente un derivado del acido glutamico. (Ver Esquema)
Esquema: Diseño de la Sintesis del Tripeptido Glutation.
La principal dificultad en la síntesis es proteger adecuadamente el grupo tiol de la cisteína y lograr el acoplamiento selectivo del grupo -carboxilico del acido glutámico.
La proteccion del grupo tiol casi siempre se realiza mediante el grupo S-bencil, sin embargo se utilizan otros grupos (como por ejemplo el tritilo -trifenilmetilo-) además de disulfuro libre para tal fin.
El segundo problema se resuelve con un protector especificio para grupos -carboxílicos. El acoplamiento del grupo -carboxílico se logra por activacion selectiva, como un ácido N-benciloxicarbonil glutámico--azida, mediante protección selectiva del grupo -carboxi, como un -etil-N-benciloxicarbonilglutamato, o mediante otros métodos.
Otros P'éptidos sintetizados en laboratorio.
Algunos peptidos de origen natural y funciones en el cuerpo humano han sido sintetizados en el laboratrio. A continuacion, una lista de los mas comunes y representativos de esata industria.
Angiotensina
Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe
Gramicidina S.
Pro-Val-Orn-Leu-Phe
Phe-Leu-Orn-Val-Pro
Oxitocina
Iso- Tir – Cis
Glu-Asp-Cis-Pro-Leu-Gli-NH2
NH2 NH2
Bradiquidina.
Arg-Pro-Pro-Gli-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg.
Kalidina.
Lis-Arg-Pro-Pro-Gli-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg.
Metionilisilbradiquidina.
Met- Lis-Arg-Pro-Pro-Gli-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg.
Filoquinina.
Arg-Pro-Pro-Gli-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg.-Ile-Tys.
Hormona Estimulante de los a -melanocitos. (a -MSH).
Ac-Ser-Tir-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gli-Lis-Pro-Val-NH2.
Hormona Estimulante de los b -melanocitos (b -MSH).
Asp-Glu-Gli-Pro-Tir-Lis-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gli-Ser-Pro-Pro-Lis-Asp.
Corticotropina (ACTH).
Ser-Tir-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Glu-Lis-Pro-Val-Gli-Li-s-Lis-Arg-Arg-Pro-Val-
Lis-Val-Tir-Pro-Asp-Gli-Ala-Glu-Asp-Glu-Leu-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe.
Síntesis de Péptidos en Fase Sólida.
El método clásico de síntesis de péptidos funciona bien para unidades pequeñas, y se han sintetizado, muchos péptidos co este proceso. Sin embargo, las proteínas mayores no se sintetizan con facilidad con este método. Se requiere de un gran numero de reacciones y purificaciones químicas. Aunque los rendimientos individuales son excelentes, con un péptido grande el rendimiento general se hace tan pequeño que no es practico, y se necesitan varios meses (o años) para completar tantos pasos. El tiempo necesario y los bajos rendimientos generales se deben principalmente a los pasos por
purificacion. Para los péptidos grandes y las proteínas se prefiere la síntesis en fase solida.
En 1962, Robert Bruce Merrifield de la Universidad Rockefeller, desarrolló un método para la síntesis de péptidos sin tener que purificar los productos intermediarios. Esto lo logró fijando las cadenas crecientes de péptidos a perlas sólidas de poliestireno.
Después de agregar cada aminoácido, se lava el exceso de los reactivos enjuagando las perlas con solvente.
En este apartado solo mostraremos la fijación del péptido al soporte sólida, lo demás es exactamente igual a la síntesis clásica de péptidos mencionada líneas arriba.
Fijación del péptido al soporte sólido.
La diferencia más grande entre la síntesis clásica y la síntesis en fase sólida es que esta última se lleva a cabo hacia atrás, es decir el grupo carboxilo del ultimo residuo aminoacidico del peptido a ser sintetizado se fija a la resina polimérica que es el soporte sólido.
El soporte sólido es una perla de poliestireno especial en que algunos de los anillos
aromáticos tienen grupos clorometilos. Este polímero que se llama RESINA DE
MERRIFIELD en honor a su inventor, se fabrica copolmerizando estireno en bajos
porcentajes de p-clorometil estireno.
Ecuación de Formación de la resina de Merrifield.
Como otros halogenuros de bencilo, los grupos clorometilo del polímero son bastante reactivos con respecto al ataque SN2. El grupo carboxilo de un aminoácido previamente protegido en N desplaza al cloruro, formando el éster del aminoácido con el polímero.
En efecto, el polímero funciona como el alcohol de un éster que es el grupo protector carboxilo del extremo-C del aminoácido.
Ecuación de Fijación del aminoácido al extremo-C
Una vez que el aminoácido se ha fijado, la cadena se construye sobre el grupo amino. Al término de la síntesis, se rompe el enlace éster con el polímero mediante HF anhidro.
Como es un enlace éster, se rompe con mas facilidad que los enlaces amidas del péptido.
Ecuación de eliminación del Soporte sólido:
La automatización total del sistema, se puede describir en lineas generales por medio de un "tocador de piano", instrumento parecido a un cilindro conectado a recipientes de disolventes de lavado, grupos bloqueadores, grupos activadores y aminoácidos a través de una serie de válvulas selectoras. Se programó asi las secuencias de adición, lavado y drenado necesarias en la síntesis de un péptido dado, de modo que todo el proceso, una vez iniciado, pueda continuar hasta completarse por si mismo. El recipiente de reacción que contiene el soporte sólido, se divide en dos partes separadas por un disco de cristal aglomerado y se conecta a un vibrador.
Después que se le ha agregado un reactivo al soporte sólido y que ha reaccionado por la vibración, se aplica una succión y cualquier material que no haya reaccionado pasa a través de los discos aglomerados a los depósitos de desperdicios y al final vuelven a reciclarse y se purifican para su uso
futuro. En la figura a continuación, Ud. puede observar un esquema representativo del aparato diseñado por Merrifield para la síntesis de péptidos.
El sístema automatizado se empleo por primera vez satisfactoriamente para sintetizar el nonapéptido bradiquidina e 1965. El proceso completo tomo casi una semana y dio un rendimiento total de casi 68%. Esta proeza fue notable en comparación con los métodos comunes empleados en esa época. La versatilidad de esta técnica fue demostrada por el grupo de Merrifield cuatro años más tarde en la síntesis total de la ribonucleasa, proteína que contenía 124 residuos aminoacídicos en tan solo seis semanas y con un rendimiento del 17%.
El trabajo de Merrifield en la síntesis de péptidos en fase sólida ameritó se le concediera el Premio Nobel en 1984.
Esquema de la máquina automática de Merrifield para la síntesis de péptidos.
1. La síntesis de péptidos no es un proceso dificil de entender desde el punto de vista de la formacion del enlace tipo amida, pero dadas las condiciones, el proceso se hace complejo debido a la relativamente debil asociacion del grupo carbonilo y el grupo amino.
2. La polifuncionalidad de la molecula, es decir, la tendencia a ser acido y base a la vez, incrementa las probabilidades de error al momento de formar el enlace peptidico, pues hay cierta tendencia a desproporcionar las uniones en virtud del choque molecular.
3. El entorno quimico dificulta aun mas las probabilidades de union, aun mas, incrementa la acides o basicidad de la molecula cuando posee grupos funcionales de tendencia definida (acidos o basicos).
4. Los aminoacidos son moleculas quirales, existen tendencia a la racemizacion pues no hay un patron que involucre una forma de ataque especial para respetar la asimetria. Aun asi, se puede lograr evitando el uso de condiciones fuertes y reactivos racemificantes. Ese punto no fue motivo de este trabajo y constituye hoy en dia todo una rama de investigación.
5. El efecto que se logra con los grupos protectores y activadores es sobre la permisividad electronica al momento de asociarse la molecula protegida o activada sobre la otra, si tenemos en cuenta que los grupos protectores son voluminosos notaremos un marcado impedimento estérico para lograr el primer próposito. De la misma forma, el poceso de activacion consta de adherir al grupo funcional
carboxilico una molecula jaladora de electrones, con lo que aumenta su afinidad nucleofilica o mejor dicho sus proibabilidades de union con el grupo amino del aminoácido contrario.
6. Los rendimientos estan afectados por los lavados sucecivos al eliminar los grupos protectores, aun asi, no hay tecnica de eliminacion de estos que deje intacto los enlaces peptidicos, siempre hay perdidas, pueslas condiciones en las solucions a utilizar no son homogeneas.
7. El incremento en la longitud de la cadena disminuye el porcentaje de rendimiento en virtud de la dificultad entre los choques moleculares para lograr una asociación efectiva, sin embargo, con la técnica de Fase Sólida se logra controlar en cierta forma los movimientos descontrolados de la misma sujetándola a una resina especial y dejando el extremo un extremo libre listo para las futuras reacciones. No podemos dejar de decir que los rendimientos son bastante altos en comparación con el método utilizado en la síntesis clásica.
LIBROS
1. GILCHRIST. T. L. "Quimica Heterociclica". 2da Edicion. Ed. Addison-Wesley
Iberoamericana. 1995. Delaware.
Paginas consultadas: 285-293.
2. LAW, Harry D. Y OTROS " The organic chemistry of peptides" Ed. Wiley. 1970.
London.
Paginas consultadas:38-150. (Fuente: PUCP-Biblioteca Ciencias. COD:
QD/431/L31)
3. KOPPLE D., Kenneth Y OTROS "Peptides and aminoacids". Ed. W.A. Benjamin.
1966. New York.
Paginas consultadas:42-64. (Fuente: PUCP-Biblioteca Ciencias. COD:
QP/801.A5/K75)
4. STREITWIESER a. y C.H. Heathcock "Quimica organica". 3ra Edicion. Ed.
McGraw-Hill Interamericana. 1989. Mexico.
Paginas consultadas: 1027 – 1034.
JOURNALS
5. "The Journal of Organic Chemistry" Vol 38, Num 17, [3034-3038] 1973.
Articulo: "Amino Group Protection in Peptide Synthesis: The 4,5-Diphenyl-4-
oxazolin-2-one Group" John C. Sheehan and Frank s. Guziec Jr.
Candy Janice Ruiz Martel
MSc Química Orgánica.
Pontificia Universidad Católica del Perú.
Lima.
José Luís Escalante Salinas
Qco Puro especializado en Productos Naturales
Vilduca Int.
Belice (Centro América)
Categoría : Química, Bioquímica
Fecha de Realización del Trabajo: Noviembre del 2000.
Lugar de Realización: Universidad Nacional Federico Villarreal. Escuela Profesional de Quimica.
Programa de Química Oranica III. Lima. Perú