Sistemas de modificación celular (página 2)

13 La eficiencia de transfección depende de la superación de varias barreras: adsorción del complejo de transfección en la superfície celular y entrada del complejo en la célula (membrana plasmática) liberación del ADN del endosoma y escape a la degradación lisosomal translocación a través de la membrana nuclear y entrada en el núcleo Barreras que tiene que superar el ADN http://www.nano-lifescience.com/research/gene-delivery.html

14 1. Métodos químicos Coprecipitación con fosfato cálcico: precipitado de complejos fosfato cálcico-ADN que son endocitados por la célula

ADN + CaCl2

Añadir Na2PO4 en tampón

Precipitados de CaPO4 con ADN

endocitosis

15 1. Métodos químicos DEAE-dextrano (dietilaminoetil-dextrano): complejos de polímeros DEAE-dextrano y ADN, se introducen por shock osmótico con DMSO o glicerol Se utiliza solo en transfecciones transitorias.

16 1. Métodos químicos Lípidos catiónicos: los liposomas catiónicos se acomplejan con el ADN y al fusionarse con la membrana celular, facilitan la entrada del ADN a través de endosomas Este método recibe el nombre de Lipofección

17 Protocolo de Lipofección

18 1. Métodos químicos Lípidos catiónicos: Alta eficiencia de transfección y baja toxicidad en determinados tipos celulares Gen marcador: ?-galactosidasa

19 1. Métodos químicos PEI (polyethylenimine): Es un polímero catiónico sintético que genera complejos con el ADN. Estos complejos interaccionan con los proteoglicanos aniónicos de la membrana y entran por endocitosis

20 1. Métodos químicos PEI Lípidos catiónicos Comparación entre dos métodos de transfección en células HEK293 Gen marcador: GFP (green fluorescent protein)

21 DNA transfection of various cell lines, including CHO-K1, COS-7, NIH3T3, HeLa S3, with CellLine Transfection Reagent 1. Métodos químicos Comparación de la eficiencia de la lipofección entre distintas líneas celulares

22 Factores que pueden influir en la eficiencia de Transfección Presencia de antibióticos El complejo puede interaccionar con el antibiótico disminuyendo la eficacia y aumentando la toxicidad

Presencia de suero El suero puede disminuir la eficiencia de transfección Aunque la ausencia de suero puede hacer el liposoma más tóxico para las células

23 2. Métodos físicos Microinyección: consiste en la inyección directa del ADN al citoplasma o núcleo de la célula

Biolístico (biological ballistics): implica la introducción de micropartículas de tungsteno u oro recubiertas con ADN con una pistola de helio.

Electroporación: se basa en la generación de un shock eléctrico corto que origina pequeños orificios a la membrana que permiten la entrada del ADN. Elevada eficiencia, pero también elevada muerte celular

Magnetofección: utiliza nanopartículas magnéticas para facilitar la entrada del ADN en las células

24 Microinyección Introducción de soluciones de macromoléculas mediante capilares finos de vidrio que se manipulan bajo un microscopio.

25 Microinyección Limitaciones Dificultad técnica (requiere personal y instrumentación especializados) Manipulación individualizada de las células (elevado consumo de tiempo) Seguimiento individual de cada célula microinyectada

Aplicaciones más corrientes: Microinyección de células adherentes en cultivo Generación de animales transgénicos (microinyección de ADN en el pronúcleo masculino del zigoto) Fecundación in vitro de oocitos (inyección de esperma en el citoplasma del oocito)

26 Biolistic particle delivery Método de transfección mediante bombardeo de las células con micropartículas de oro o tungsteno recubiertas con ADN o ARN. Helios Gene Gun – BioRad Aplicaciones: Recomendado para células resistentes a otros métodos y especialmente para células vegetales

27 Electroporación Introducción de macromoléculas en las células mediante la exposición a un pulso eléctrico de elevada intensidad y corta duración que provoca la apertura de poros en la membrana plasmática. Ventajas: Técnica simple, reproducible y de gran eficacia

Desventajas: Requiere desenganchar las células del sustrato Mucha mortalidad celular Se tienen que ajustar las condiciones para cada tipo celular

28 Electroporación Parámetros: Amplitud del pulso (Voltaje en kV/cm) Longitud del pulso (de ?seg a mseg)

Normalmente las condiciones que permiten una mayor eficiencia de transfección provocan una muerte celular de entre el 40 y el 60%

En la actualidad existen también sistemas de electroporación para células adheridas al sustrato y para realizar electroporaciones in vivo.

29 MagnetofecciónMATra – Magnet Assisted Transfection Utilización de nanopartículas magnéticas para mejorar la entrada de biomoléculas, como el ADN, dentro de las células.

30 Transfección transitoria: expresión de la proteína exógena durante un período corto (1 a 4 días). El ADN no se integra en el genoma de la célula. Transfección estable: permite la expresión de la proteína indefinidamente (en teoría). Se consigue mediante la selección de los clones que hayan incorporado el plásmido en su genoma (Tasa de inserción= 1 célula de cada 10000). Tipos de transfección http://www.promega.com/guides/transfxn_guide/transfxn.pdf

31 Ventajas Elevado nivel de expresión Es fácil co-expresar varias proteínas Procedimiento fácil y rápido Ventajas Población celular homogénea (clonal) Producción continua de proteína (teóricamente) Almacenamiento de células expresoras del transgen Transfección transitoria vs. Transfección estable Transfección transitoria Transfección estable Inconvenientes Variabilidad en el porcentaje de células expresoras (población celular heterogénea) Obtención de poca cantidad de proteína (producción temporal) Requiere gran cantidad de plásmido Inconvenientes Integración del transgen al azar en el genoma celular Niveles de expresión moderados Es complicado obtener la co-expresión de varias proteínas Procedimiento laborioso y largo de selección clonal

32 1/10000 céls. Colonias de células estables Se tripsinizan individualemente Se cultivan y amplifican para testar y caracterizar la expresión del gen Transfección Adición antibiótico 1 mes 2 días 1-2 semanas Muerte masiva células no estables 2 semanas 2 meses Clones estables: procedimiento de obtención

33 Sin selección muerte de células no expresoras crecimiento de los clones estables Cassettes de resistencia: NEO: Selección con G418 (0.1-1.0 mg/ml) HYG: Selección con Higromicina-B (10-300 mg/ml) PAC: Selección con puromicina (0.5-5 mg/ml)

Estos antibióticos actuan inhibiendo la síntesis proteica Clones estables: selección con antibiótico Con selección aparición de clones resistentes

Sistemas de modificación celular SubIntroducción Genes marcadores Técnicas de introducción de ADN en las células animales en cultivo Transfección Métodos químicos Métodos físicos Establecimiento de líneas de expresión estable Transducción: vectores virales Adenovirus Retrovirus y Lentivirus Métodos de introducción de proteínas

35 Transducción: vectores virales Adenovirus Retrovirus Lentivirus Herpes virus Adeno-associated virus

36 Vectores virales: Adenovirus Grupo de virus benignos, baja patogenicidad (ej. resfriado común) Genoma: ADN de doble cadena linear con una proteína unida covalentemente al extremo 5’ (TP: terminal protein). Longitud aprox. 36 kb Simetria icosahédrica (80-100 nm diámetro) Proteínas de la cápside: Hexon, penton base, fibra globular

37 Vectores virales: Adenovirus Ciclo del Adenovirus

Entran mediante la unión (alta afinitat) a receptores específicos de la célula diana mediada por el extremo globular de la fibra Endocitosis del virus Sale del endosoma y transloca al núcleo El ADN viral entra en el núcleo y empieza la transcripción La transcripción, la replicación y el empaquetado tienen lugar dentro del núcleo de la célula infectada.

38 Vectores virales: Adenovirus Genoma del Adenovirus

Se transcriben las dos cadenas de ADN

Transcripción en dos fases: Early: E1, E2, E3 i E4 (antes de la replicación del ADN) Late: (después de la replicación del ADN)

39 Vectores virales: Adenovirus Vector Adenoviral

Virus deficientes en la replicación- deleción de las regiones E1 (esencial para la replicación) y E3 (modulación respuesta immune huésped). El inserto puede ser de 7 a 8 kb (gene-X) Empaquetado en una línea celular que proporciona los productos de E1 y E3 en trans (normalmente HEK293)

40 Vectores virales: Adenovirus Ventajas Infectan un amplio rango de células de mamífero con elevada eficiencia Infectan tanto células en división como células que no se replican Elevados niveles de expresión de la proteína Se pueden obtener adenovirus en gran cantidad (adecuado para terapia génica) El ADN no se integra en el genoma por lo tanto no produce mutagénesis (epicromosómico) Se pueden utilizar en cultivos en suspensión (producción de proteína a gran escala) Sistema homólogo para genes humanos

41 Vectores virales: Adenovirus Inconvenientes Limitación en el tamaño del inserto (7-8 kb) Expresión transitoria de la proteína

Aplicaciones Transducción de ADN en células de mamífero para estudios de funcionalidad de proteínas Obtención de proteína recombinante por sobre-expresión en células humanas Terapia génica “in vivo”

42 Oncoretrovirus (retrovirus) ej. Moloney Murine Leukemia Virus Sólo infectan células en división

Lentivirus ej. HIV Infectan tanto células en división como quiescentes Retrovirus

43 Vectores virales: Retrovirus Dos copias de ARN de cadena simple envuelto de proteína (ssRNA) Codifica por una transcriptasa reversa (RTase: RNA-dependent DNA polymerase) Sólo infecta a células en división Se integra en el genoma de la célula

44 Vectores virales: Retrovirus Ciclo del retrovirus Infección célula diana Genoma RNA ? copia DNA ? transporte al núcleo Integración del ADN al cromosoma Transcripción DNA viral ? mRNA Traducción mRNA ? gag, pol, env Formación cápside: empaquetamiento de mRNAs/RTase Partículas virales liberadas

45 Vectores virales: Retrovirus Construcción Vector Retroviral ¿Qué es imprescindible? 5’ LTR (promotor) y 3’ LTR (polyA) señal de empaquetamiento

No se necesita: gag, pol, env estas proteínas las puede proporcionar la línia celular utilizada para la producción de los viriones

46 Vectores virales: Retrovirus (Gp:) Promotor

Gag- proteínas estructurales internas de la cápside Pol- Rtase, integrasa, proteasa Env- proteínas de la cápside (Gp:) Genoma retroviral

(Gp:) Vector retroviral (Gp:) Promotor

Tamaño máximo del inserto ? 8kb

Construcción Vector Retroviral

47 Vectores virales: Retrovirus Obtención de los Retrovirus Línea celular empaquetadora Producción de los retrovirus

48 Vectores virales: Retrovirus Ventajas: Expresión estable de la proteína (integración del ADN al genoma) Puede infectar células de distintas especies (insectos, amfibios, peces, aves, mamíferos)

Inconvenientes: Limitación tamaño inserto ( 8 kb) Dificultad de producción a gran escala de los retrovirus No infecta células que no se repliquen La inserción del ADN al genoma puede producir mutagénesis insercional

Aplicaciones: Introducción de ADN en células en cultivo para obtener expresión estable Terapia génica “ex vivo”

49 Lentivirus

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52 Métodos de transfección de péptidos, proteínas o anticuerpos Microinyección Electroporación Lípidos catiónicos BioPorter® (Genlantis) Pro-Ject (Pierce) “Carriers” de composición desconocida: Chariot? (Active Motif) ProteoJuice ? (Novagen) TransPass™ P (New England Biolabs) BioTrek™ Protein Delivery Reagent (Stratagene)

53 Aplicaciones Estudiar la función de la proteína introducida Inhibir la actividad de una proteína celular endógena Analizar la distribución subcelular de la proteína introducida Realizar inmunodetección de proteínas en células vivas

54 BioPORTER? Reagent www.genetherapysystems.com

55 Pro-Ject Protein Transfection Reagent http://www.piercenet.com/ Efficient protein delivery in hours instead of days. This is a unique cationic lipid mixture which, when complexed with proteins or peptides, allows direct intracellular delivery of proteins, peptides, antibodies and other biologically active molecules. Pro-Ject Protein Complexes attach to negatively charged cell surfaces and either can directly fuse with the membrane and deliver the captured protein into the cell or be endocytosed by the cell and then fuse with the endosome, releasing the captured protein into the cytoplasm (Figure 1). Since the complex formed is noncovalent it does not interfere with the protein's biological activity.

56 Chariot™ simple, efficient protein delivery Chariot™* is a revolutionary delivery reagent that quickly and efficiently transports biologically active proteins, peptides and antibodies directly into cells. The typical delivery efficiency is 60-95%. Less than two hours after delivery, live cells can be assayed to determine the effects of the introduced material, without the need for fixing. This makes Chariot an ideal tool for functional studies, including delivering inhibitory proteins, labeling organelles, screening peptide libraries and studying protein half-lives & transient complementation.

The Chariot™ Advantage Works in a variety of cell lines Facilitates functional studies in living cells — no fixing required Works in vivo (1) Fast and efficient — 60-95% transfection in less than 2 hours No need for expression of fusion proteins Non-cytotoxic, serum independent