Sistemas de modificación celular SubIntroducción Genes marcadores Técnicas de introducción de ADN en las células animales en cultivo Transfección Métodos químicos Métodos físicos Establecimiento de líneas de expresión estable Transducción: vectores virales Adenovirus Retrovirus y Lentivirus Métodos de introducción de proteínas
2 Manipulación del cultivo celular para la modificación de la expresión y/o función de los genes. Ácidos nucleicos ADN: construcciones con la secuencia codificante del gen de interés,… ARN: puede ser codificante o regulador (RNAi o antisense) Proteínas: para evaluar su función o inhibirla con proteínas competidoras (dominante negativo) Anticuerpos: para neutralizar la función de una proteína
3 ¿Con qué finalidad queremos introducir ADN en una célula? Conferirle ventajas selectivas (ej. resistencia a una sustancia tóxica) Caracterizar la función de la proteína de interés Conocer la localización subcelular de una proteína (proteína marcada) Facilitar el estudio de la regulación de la expresión de un gen (región reguladora de la expresión del gen + gen marcador) Obtener proteína recombinante procesada correctamente por células de mamífero
4 Condiciones ideales de introducción del ADN El método y las condiciones óptimos para cada tipo celular se tienen que establecer empíricamente Eficiencia máxima Toxicidad nula
5 Estrategias de introducción de ADN
Transfección: introducción del gen exógeno por métodos químicos o físicos Vector: plásmido de expresión
Transducción o infección: introducción del gen exógeno mediante vectores virales Vector: material genético del virus
6 Transfección: vector Componentes de un plásmido de expresión de células de mamífero:
Origen de replicación en bacterias (ColE1): para mantener y amplificar el ADN Gen de resistencia a un antibiótico (p.e. ampicilina): para seleccionar las bacterias que tienen el plásmido
Promotor secuencia que controla la expresión del transgen (p.e. pRSV expresión elevada y constitutiva) Sitio de clonage: “multi cloning site” MCS (donde se introduce la secuencia de ADN de interés) Señal de poliadenilación (finalización del ARN mensajero) Gen de resistencia a un antibiótico para la selección de las células que han incorporado el plásmido en su genoma (p.e. Neomicina o Higromicina).
(Gp:) Amplificación del vector en bacterias
(Gp:) Expresión del gen en células de mamífero y selección de clones estables
7 Vector de expresión para células de mamífero MCS: multi cloning site Para amplificación y selección en bacterias Promotor Seq. de poliadenilación Promotor Gen de resistencia a la neomicina (selección en céls. mamífero) Seq. de poliadenilación http://www.invitrogen.com
8 Permiten: Controlar la eficiencia de entrada del ADN Estudiar la regulación de la expresión de un gen Monitorizar la localización subcelular de la proteína Genes marcadores o “reporter” Aplicaciones: Normalización de los ensayos de expresión Seguimiento de una proteína marcada con un gen reporter Optimización de la metodología de introducción del ADN
Codifican para proteínas de fácil detección
9 Genes “reporter” más comunes Chloramphenicol acetyl transferase (CAT) Enzima bacteriano que transfiere grupos acetilo del acetil-coenzima A al antibiótico cloranfenicol. El ensayo CAT se realiza con cloranfenicol radiactivo por lo que se detecta por autorradiografía.
Luciferasa (luc) Enzima expresado en la luciérnaga Photinus pyralis. Cataliza la oxidación de las luciferinas, reacción que emite luz. La producción de luz se puede medir con un luminómetro. ?-galactosidasa (?-gal or lacZ) Enzima bacteriano muy versátil, su actividad se puede medir tanto en extractos celulares con un espectrofotómetro (aparición de producto coloreado) y por métodos histoquímicos con la aparición de un precipitado azul en las células que lo expresan.
10 Green fluorescent protein (GFP) El gen de esta proteína autofluorescente ha sido el gen marcador más útil para visualizar las células transfectadas in vivo. La GFP se obtuvo de la medusa Aequorea victoria. La exposición de la GFP a luz ultravioleta produce la emisión de una luz verde brillante en células vivas, sin la necesidad de añadir ningún sustrato o producto. En la actualidad se han clonado proteínas fluorescentes a partir de otras especies de medusa, anémonas y corales AmCyan1 ZsGreen1 ZsYellow1 DsRed1 AsRed2 HcRed1. Nuevas proteínas fluorescentes disponibles: Genes “reporter” más comunes
11 Métodos de Transfección Métodos químicos: Se mezcla el ADN con moléculas cargadas positivamente que facilitan la entrada del ADN en la célula (moléculas portadoras o “carrier”)
Métodos físicos: Introducción del ADN de forma directa
12 Métodos de Transfección Métodos químicos: Coprecipitación con fosfato cálcico DEAE-dextrano Lípidos catiónicos Polyethylenimine (PEI)
Métodos físicos: Electroporación Microinyección “Biolistic Particle Delivery” o “Gene gun” Magnetofección
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