Estandarización de la PCR y generalidades

1. Resumen
2. Selección de las concentraciones óptimas de reactivos, parámetros del protocolo y equipamiento
3. ADN molde
5. Diseño y concentración de los cebadores
6. Composición del buffer de reacción y aditivos
7. Parámetros del programa de amplificación
8. Precauciones en la PCR
9. Estimados preliminares de repetibilidad
10. Especificidad y sensibilidad analíticas
11. Rango
12. Robustez
13. Bibliografía

Resumen

El presente trabajo aborda los principales requisitos que se deben tener en cuenta para lograr una correcta estandarización de la Reacción en Cadena de la Polimerasa, así como generalidades importantes de la técnica que son imprescindibles tener en cuenta siempre que se desee emplear y lo cual es común para cualquier agente que se desee detectar. Se describen las consideraciones que se deben tener para la elección del ADN molde, enzima, cebadores, dNTPs, cloruro de magnesio, así como las concentraciones necesarias de cada uno de ellos. También se describen aspectos relacionados con el buffer de reacción así como del programa de amplificación.

La PCR fue desarrollada por Kary B. Mullis en 1983, y ha revolucionado la aplicación de la genética molecular, lo que provocó que fuese proclamada por la revista Science como el mayor hallazgo científico del año 1989. La PCR es una técnica in vitro usada para amplificar enzimáticamente una región específica del ADN, con el empleo de cebadores específicos complementarios a dicha secuencia (López, 1999).

Esta técnica brinda innumerables ventajas, las cuales han permitido su empleo en diversas investigaciones, como son su capacidad de multiplicar la porción del ADN buscada en el orden de 106-9copias lo que le confieren su altísima sensibilidad; la utilización de cebadores que reconocen una secuencia única elegida, propia de cada microorganismo, le confieren su gran especificidad; su rapidez comparada con algunas técnicas tradicionales, es otra ventaja para destacar; la característica de detectar "presencia de ADN" en vez de "viabilidad de microorganismos" permite su utilización con una gran variedad de muestras. Al mismo tiempo a pesar de sus grandes ventajas podemos ver que existe gran probabilidad de obtener resultados falsos positivos por contaminación con productos de amplificaciones anteriores (amplicones) lo que hace necesario realizar una cuidadosa evaluación de sus resultados y además se debe destacar la falta de estandarización de las técnicas home made (Técnicas moleculares en la práctica diaria, 1999), aunque recientemente la mayoría de los laboratorios que emplean este procedimiento realizan su estandarización con el propósito de obtener resultados confiables.

La PCR está revolucionando el diagnóstico de numerosas enfermedades infecciosas, particularmente aquellas causadas por organismos difíciles de cultivar y además se ha convertido en una herramienta esencial a emplear en diversos procedimientos comunes como el clonaje de fragmentos específicos de ADN, para la detección e identificación de genes en el diagnóstico y la medicina forense, detección de mutaciones, diagnóstico de enfermedades hereditarias o determinación del sexo del feto previamente a su implantación en procesos de fecundación in vitro y en investigaciones relacionadas con marcadores de paternidad (Najar y Mirdamadi, 2005).

Un ensayo estandarizado es un método que brinda constantemente el mismo resultado para una muestra dada cuando se ha repetido varias veces y realizado por diversos analistas, en diferentes laboratorios (Practical Molecular Biology, 2003; Manual OIE, 2004).

Para estandarizar un ensayo analítico, primeramente es necesario demostrar y comprobar si el método es útil o no para el fin que fue diseñado, utilizando para ello material de referencia, que permita obtener resultados confiables (Binder, 1997c; Manual OIE, 2004).

El desarrollo y estandarización de un sistema de PCR incluye optimizar toda una serie de parámetros críticos de los cuales depende este método y determinar parámetros imprescindibles que permita plantear que el sistema diseñado es confiable (Binder, 1997h; Practical Molecular Biology, 2003).

Selección de las concentraciones óptimas de reactivos, parámetros del protocolo y equipamiento

La típica reacción de amplificación incluye la secuencia blanco, la enzima ADN polimerasa, dos oligonucleótidos, desoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs), cloruro de magnesio (MgCl2), el buffer de reacción y aditivos opcionales, que todos son mezclados y colocados en un termociclador automático que realiza los ciclos en los tiempos y temperaturas programadas de forma exacta (Henegariu, 2000b; Promega Technical Bulletin, 2005). Todos estos parámetros son necesarios optimizar para lograr un correcto funcionamiento del sistema.

ADN molde

La correcta amplificación de la región de interés es dependiente de la cantidad y calidad del ADN molde. Los reactivos que se emplean normalmente para purificar los ácidos nucleicos (sales, guanidinio, proteasas, duodecil sulfato de sodio (SDS) y solventes orgánicos) son inhibidores potentes de las ADN polimerasas (Promega Technical Bulletin, 2005).

Existen una serie de reglas sencillas para que el ADN molde no sea un problema en la reacción: (1) se debe garantizar su integridad, es decir no puede estar fragmentado en trozos más pequeños del que se desea amplificar, (2) la muestra no debe llevar agentes quelantes (EDTA) que reducen la concentración de iones Mg2+ en la solución (Barbeyrac y col., 1996) y (3) no debe haber determinados factores sanguíneos, fenol, detergentes que pueden inhibir la actividad de la polimerasa (Practical Molecular Biology, 2003).

Si se desea amplificar un gen de simple copia se emplean cantidades entre los 100 y 500 ng. En el caso de la amplificación de genes repetidos se puede reducir la cantidad a emplear entre los 10 y 50 ng. El mínimo oscila entre 10 y 100 ng y el máximo entre 400 y 500 ng (Lozada, 2002).