Estandarización de la PCR y generalidades (página 2)

Elección y concentración de la enzima

Existen diferentes tipos de ADN polimerasa que llevan a cabo la replicación del ADN. Estas se pueden clasificar en: Termolábiles (Temperatura óptima de 37ºC a 42ºC, se desnaturalizan con el calor) y termoestables (Temperatura óptima de 74 ºC, resiste entre 40 a 50 segundos a 96ºC) (Lozada, 2002).

Una de las más utilizadas ha sido la Taq ADN polimerasa (Mas y col., 2001). Es una enzima termoestable aislada de Termus aquaticus (Taq), una bacteria que soporta altas temperaturas. Carecen de actividad 3´-> 5´ exonucleasa, lo que las hace menos seguras a la hora de comparar las fidelidades. Por ello hay que intentar obtener las mejores condiciones para garantizar su correcto funcionamiento, para lo que se recomienda no usar un alto número de ciclos, las concentraciones de los dNTPs deben ser iguales, disminuir en lo posible el tiempo de cada etapa y la concentración de MgCl2 debe oscilar entre 1.5 mM y 3.0 mM (Binder, 1997g).

Se recomienda utilizar entre 1 y 1.25 U de enzima en 50µl de reacción. Incrementos en la cantidad de enzima y del tiempo de extensión genera la aparición de artefactos debido a la actividad exonucleasa intríseca 5´ -> 3´ de la enzima (Promega Technical Bulletin, 2005; Promega protocolos, 2005 y Lozada, 2002).

Diseño y concentración de los cebadores

Los cebadores deben tener un tamaño entre las 18 y 30 pb. Se recomienda que el contenido de G+C oscile entre el 40 y 60%, evitando la presencia de regiones con largas secuencias de una sola base, así como secuencias que puedan producir estructuras secundarias internas. Los extremos 3´ no deben ser complementarios, para evitar la formación de dímeros. Se debe evitar además la presencia de tres G ó C cerca del extremo 3´ (Henegariu, 2000g; Brinkmann Instruments, 2004).

La temperatura de alineamiento (Ta) de los cebadores debe ser similar en ambos, la cual generalmente oscila entre los 45 ºC y 60 º C. La secuencia de los cebadores puede incluir en el extremo 5´ sitios de corte para enzimas de restricción, lo cual dependerá del propósito de la investigación (Binder, 1997d; Henegariu, 2000c).

La concentración de cebadores a emplear debe oscilar entre los 5 y 50 pmoles, para una concentración final de 0.1 y1µM en 50 µl de reacción (Promega Technical Bulletin, 2005).

Deoxinucleótidos trifosfato

Los dNTPs deben ser añadidos en la reacción en iguales concentraciones, puesto que los mismos pueden captar iones Mg2+. Por lo general la concentración final más utilizada de dNTPs en un volumen de reacción de 50 µl es de 0.2 mM (Brinkmann Instruments, 2004; Henegariu, 2000e)

Concentración de Cloruro de magnesio

La concentración de magnesio es un factor crucial que afecta el funcionamiento de la enzima Taq ADN polimerasa. Los componentes de la reacción tales como: el ADN molde, agentes quelantes presentes en la muestra (EDTA o citrato), dNTPs y proteínas pueden afectar la cantidad de magnesio libre (Henegariu, 2000d; Promega Technical Bulletin, 2005). Su carencia puede inactivar la enzima y su exceso reduce la fidelidad de la enzima y puede incrementar las uniones inespecíficas (Eckert y Kunkel, 1990). Por tales razones resulta imprescindible determinar la concentración óptima de esta sal, la cual generalmente se encuentra en el rango de 1.5 a 3.0 mM.

Composición del buffer de reacción y aditivos

Por lo general el buffer de reacción 10x está formado por 100 mM tris-HCl (pH entre 8 y 9 a 25ºC), 500 mM KCl, 0.1% gelatina, 1% de Triton x-100 y 15mM de MgCl2. El buffer tris es el encargado de regular el pH de la reacción, el cual afecta la actividad y fidelidad de la enzima. Moderadas concentraciones de KCl pueden incrementar la actividad de la enzima de un 50 a un 60% por encima de la activivdad en ausencia de esta sal, cuya concentración óptima a emplear es de 50mM (Binder, 1997a; Henegariu, 2000f).En ocasiones se hace necesario el uso de aditivos, los cuales ayudarían en la práctica a aumentar la especificidad y fidelidad de la PCR. La adición de betamina, dimetilsulfóxido (DMSO) y formamida es beneficioso cuando el ADN molde posee regiones ricas en GC y forma potentes estructuras secundarias del ADN que puede provocar que la polimerasa se detenga (Rees y col., 1993). El ADN con regiones ricas en GC puede ocasionar una ineficiente separación de las dos cadenas del ADN, por lo tanto la adición de aditivos en estos casos es beneficiosa, pues la betamina reduce la cantidad de energía requerida para separar las cadenas del ADN molde y el DMSO y formamida interfieren en la formación de enlaces de hidrógeno entre ambas cadenas. También se pueden usar detergentes como el tween 20, laureth 12 (0.1%) o Tritón x-100, que ayudan a estabilizar la enzima. Existen también protocolos que incorporan polietilenglicol (PEG), glicerol, seroalbúmina bovina (BSA), etc., aunque no son en ningún caso imprescindibles (Lozada, 2002; Promega protocolos, 2005).

El volumen de la reacción es variable, aunque en muchas ocasiones se recomienda emplear volúmenes pequeños cuando se utilizan pequeñas cantidades de ADN (Henegariu, 2000h).

Parámetros del programa de amplificación

Los dos parámetros que comúnmente se optimizan son la temperatura y el tiempo de alineamiento. Los tiempos y temperaturas del resto de las etapas usualmente no varían significativamente (Henegariu, 2000a; Promega protocolos, 2005).

Un tiempo de alineamiento de 30 a 45 segundos es frecuentemente empleado. Se plantea que incrementos de 2 a 3 minutos tienen una influencia negativa en la reacción. Sin embargo como la Taq polimerasa tiene actividad reducida entre los 45ºC y 65ºC (intervalos a los cuales son elegidas la mayoría de las temperaturas de alineamiento), tiempos más largos suelen incrementar la probabilidad de aparición de productos inespecíficos (Practical Molecular Biology, 2003).

Las secuencias de los cebadores son una consideración importante en la determinación de la temperatura de alineamiento óptima de la PCR. Los cebadores que poseen una temperatura de fusión (Tm) alta, se recomienda aumentar la temperatura de alineamiento, pues de esta forma se reducen al mínimo las uniones inespecíficas, aumenta la cantidad de producto amplificado y se reduce la formación de dímeros (Binder, 1997b). La temperatura de alineamiento óptima dependerá del cebador con la menor Tm, generalmente mas/menos 5ºC que la calculada, es la indicada para comenzar los estudios de optimización. Ambos cebadores deben tener una Tm similar, planteándose que si las Tm se diferencian en mas de 5ºC, uno de los cebadores debe ser rediseñado (Henegariu, 2000i).

El número de ciclos también es un aspecto importante a considerar. Este número depende de la cantidad de ADN que existe en la muestra una vez que el resto de los factores han sido optimizado. Es importante no realizar un número alto de ciclos (normalmente se emplean de 25-35 ciclos) ya que puede dar lugar a la amplificación de productos no deseados originados por hibridaciones no específicas. Hay que tener en cuenta que la reacción está producida por una enzima que sufre el efecto meseta que describe la atenuación en la tasa de acumulación del producto. Después de un número determinado de ciclos la amplificación deja producirse de manera exponencial y llega a una fase estacionaria. Generalmente cuando el efecto meseta se produce, la cantidad de ADN sintetizado es suficiente para su posterior utilización (Lozada, 2002; Promega Technical Bulletin, 2005).

Precauciones en la PCR

Este es un aspecto muy importante a tener en cuenta cuando se trabaja con esta técnica, que al ser muy sensible, es de gran importancia evitar contaminaciones, ya que es posible que el ADN no deseado (aunque se encuentre en una cantidad muy pequeña) se amplifique y obtengamos un resultado que no es real, por lo que una de sus mayores ventajas, se convierte a la vez en el principal inconveniente. Existen una serie de normas que ayudan a evitar las contaminaciones y la aparición de falsos positivos: lugar físico e instrumental exclusivo para la realización del ensayo, utilización de reactivos y tubos estériles, así como puntas resistentes a aerosol, uso de guantes, colocar controles de agua, además de colocar muestras negativas conocidas (Binder, 1997f).

Para evitar la aparición de resultados falsos negativos, producidos generalmente por errores al pipetaer y/o presencia de inhibidores, se recomienda emplear controles internos que compiten con la muestra problema (Manual de la OIE, 2004; Farmacopea Europea, 2007).

Estimados preliminares de repetibilidad

Debe existir concordancia entre los resultados obtenidos entre réplicas y en diferentes corridas. Esto brinda importante información sobre el ensayo antes que se continúe con la estandarización. Si se encuentra excesiva variabilidad, se debe corregir antes de continuar (Manual OIE, 2004).

Especificidad y sensibilidad analíticas

La sensibilidad analítica o límite de detección es la mínima cantidad de analito que es capaz de detectar el ensayo y puede ser representado como: número de copias del genoma, dosis infecciosa, unidades formadoras de colonias (UFC), etc del agente que puede ser detectado (Farmacopea Británica, 2004). Para determinar la sensibilidad analítica se recomienda calcular, para fines prácticos, el punto final de corte, el cual se define como el mínimo de secuencias blanco por volumen de muestra que es capaz de detectar el ensayo en el 95% de las réplicas. Estos estudios al realizarse en réplicas son útiles para demostrar la variación entre corridas realizadas en un mismo y en diferentes días (Manual OIE, 2004; Farmacopea Europea, 2007).

De acuerdo a lo descrito en la Farmacopea Europea, 2007 el límite de detección se debe calcular para cada especie en particular, pues se debe a la desigual distribución de cada uno en las diferentes muestras, por lo tanto el punto final de corte se plantea que debe ser calculado para cada una y requiere de al menos 3 series de diluciones de cada especie de hasta 10 diluciones en cada serie y al final se debe tener 24 réplicas de cada dilución. Para lograr esto se recomienda por ejemplo testar las 3 series de diluciones en diferentes días con 8 réplicas por cada dilución.

La especificidad analítica es la habilidad de un ensayo de distinguir o detectar el blanco específico de otros agentes infecciosos. Se determina con el empleo de patógenos genéticamente similares que se encuentran comúnmente contaminado las muestras clínicas del agente a detectar, para el cual fue diseñado el ensayo (Binder, 1997e; Manual OIE, 2004; Farmacopea Europea, 2007).

La demostración de este parámetro requiere del empleo de un amplio rango de microorganismos que presenta una estrecha relación filogenético con en agente a detectar (Farmacopea Europea, 2007)

Rango

Las técnicas analíticas se deben optimizar en la fase lineal de la curva de respuesta. La gama de un análisis se define como el intervalo entre la concentración superior y más baja de un agente infeccioso en una muestra en la cual el agente pueda ser detectado de manera confiable y reproducible (Manual OIE, 2004)

Robustez

La robustez de un procedimiento analítico es una medida de la capacidad de no afectarse por pequeñas variaciones en los principales parámetros del método (MgCl2, cebadores o dNTPs) y proporciona una medida de su confiabilidad durante el uso normal. La evaluación de la robustez debe ser considerada durante la etapa del desarrollo y estandarización del ensayo pues en esta fase del proceso se realizan pequeñas variaciones en los principales parámetros críticos (MgCl2, dNTPs, cebadores, etc) con el fin de lograr la correcta optimización y de esta forma se tienen estimados preliminares de la robustez del ensayo, la cual finalmente se confirma a través de estudios colaborativos entre laboratorios (Farmacopea Europea, 2007).

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Autor:

Yenney Hernández, MsC.*

Evelyn Lobo, DrC.,

Belkis Corona, DrC.

Siomara Martínez, DrC.

Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), La Habana, Cuba

*correspondiente autor

Biografía del autor

Graduada de Bioquímica 2005, Master en Ciencias, premios obtenidos con diversos trabajos presentados sobre el diagnostico de micoplasmas, asi como la validación de técnicas de diagnostico para la detección de micoplasmas en cultivos celulares, sueros y productos biofarmaceuticos. Trabajo presentado en evento internacional IOM, 2006. Estudios realizados: diagnostico de micoplasmas, validación de técnicas, clonaje y expresión de proteína de superficie de micoplasmas, epidemiologia molecular.