Enzimas de Restricción: Metilación La presencia de bases metiladas no siempre protege al DNA de ser cortado; ciertas enzimas solo reconocen secuencias que contienen bases metiladas. Durante la replicación del DNA sola la hebra parental (que ha servido como molde) se encuentra metilada, lo que se conoce como hemimetilada. Esta hemimetilación es suficiente para proteger la doble hélice del DNA de ser cortado por la endonucleasa de restricción
Metilación Antes del próximo ciclo de replicación la hebra nueva debe ser metilada por la enzima conocida como metilasa (figura 3).
Aplicaciones C. Aplicaciones en el uso de las endonucleasas de restricción. Entre estas se encuentran: ingeniería genética, pruebas de paternidad o maternidad y medicina forense, entre otras.
1) Ingeniería genética. A través de la tecnología de DNA recombinante cualquier segmento de DNA puede ser separado de un genoma y ligado a un genoma de otro individuo. Esta tecnología que se comenzó a utilizar con bacterias, les ha permitido a los investigadores estudiar con más precisión los genes de organismos procariota y eucariota.
Enzimas de Restriccion – animación
Aplicaciones La clonación es la técnica central de la tecnología de DNA recombinante. permite replicar (clonar) en grandes cantidades un pedazo específico de DNA. El DNA de interés es cortado y ligado a un elemento genético, vector de clonación, que se puede replicar autónomamente cuando se introduce a una bacteria en crecimiento, en la mayoría de los casos E. coli. El vector de clonación puede ser un plásmido o un bacteriófago.
Aplicaciones Tanto el DNA de interés como el vector de clonación deben ser cortados con la misma enzima.
Las enzimas más utilizadas en esta técnica son aquellas que producen terminales pegajosos. En esencia, dos fragmentos de DNA generados por la misma endonucleasa de restricción pueden unirse por el pareo de las bases complementarias en los fragmentos sencillos de cada terminal.
Primero se corta el DNA de interés y el vector de clonación con la misma endonucleasa de restricción para generar terminales pegajosos.
Luego se mezclan los fragmentos bajos las condiciones apropiadas para que las bases en los terminales se puedan unir.
Ya unidos los fragmentos, se le añade DNA ligasa para que esta una covalentemente esos fragmentos.
Aplicaciones
Aplicaciones 2) “DNA fingerprinting” Los análisis de los patrones formados por los fragmentos que se producen cuando el DNA es cortado por las endonucleasas de restricción han sido utilizados, para estudiar en detalle los genomas de diversos organismos, diagnosticar enfermedades genéticas resolver crímenes violentos. Estos análisis tienen como base el hecho de que dos personas que no son gemelos idénticos poseen diferente secuencia de nucleótidos en el DNA.
Aplicaciones – DNA Fingerprinting Aunque la diferencia en la secuencia de bases en el DNA entre dos personas sea pequeña, los fragmentos producidos por las endonucleasas de restricción son de diferentes tamaños. Esta diferencia en el tamaño de los fragmentos, conocido como patrones polimórficos de endonucleasas de restricción (restriction fragment length polymorphisms, RFLP’s), pueden ser analizados por electroforesis Los resultados en los patrones son distintivos para cada persona, por lo que funcionan como huellas dactilares (“DNA fingerprinting”).
Fingerprinting En la práctica solo una pequeña fracción de las bandas producidas por los fragmentos de restricción son examinadas. La figura 3 ilustra el proceso de “DNA fingerprinting” para determinar un caso de paternidad. En el primer paso se extrae DNA de la madre, del niño y del alegado padre. El DNA de las tres personas se somete a digestión con endonucleasas de restricción. Los fragmentos resultantes son separados utilizando electroforesis en geles de agarosa.
Fingerprinting
Fingerprinting Como el genoma de cada persona es tan grande, miles de bandas son generadas y son muy difíciles de ver en el gel. Para resolver este problema se utiliza la técnica principal del “DNA fingerprinting” conocida como “Southern blotting” (Figura 5 a). En la misma, una membrana de nitrocelulosa es presionada sobre el gel permitiendo que el patrón de bandas de DNA transfiera del gel a la membrana. Luego se le añaden sondas radioactivas a la membrana.
Fingerprinting Las sondas son fragmentos radioactivos de DNA o RNA complementarios al DNA de interés. Las sondas se unen al DNA complementario por medio del pareo de las bases. Las bandas a las cuales las sondas se han unido se hacen visibles por medio de radiografía. Los resultados observados en la figura 5 b indican que el alegado padre es el verdadero padre del niño. El mismo procedimiento es utilizado en casos de asesinato y/o para determinar si un individuo es portador de una enfermedad genética.
Fingerprinting
Materiales Materiales Agua destilada Amortiguador 10 X (específico para cada endonucleasa de restricción) Baño de agua Endonucleasas de restricción Hielo Micropipetas Microtubos de 0.5 ml Puntas para micropipetas RNAsa
Protocolo: Reacción * Es específico para cada endonucleasa de restricción. Asegúrese de mantener el amortiguador 10 X todo el tiempo en hielo. ** A cada grupo de trabajo se le asignará una endonucleasa de restricción distinta. Asegúrese de mantener la endonucleasa de restricción todo el tiempo en hielo.
Protocolo: 1) En un microtubo de 0.5 ml mezcle: 2) Coloque el microtubo con la digestión preparada en el paso 1 en un baño de María a 37 ºC. 3) Luego de una hora remueva el microtubo del baño de María y guárdelo a –20º C hasta el próximo laboratorio.
Preguntas Explique como la metilación actúa para proteger el DNA de la acción de las endonucleasas de restricción. Explique en términos biológicos porque la metilasa evolucionó en las bacterias. Teniendo en cuenta la endonucleasa con la que usted trabajó, ¿espera usted que se complete todo el proceso de restricción del DNA de E. coli o Aedes aegypti? Explique su respuesta. ¿Por qué la digestión con las endonucleasas de restricción se lleva acabo a 37 ºC? Mencione, explique y de ejemplo de una aplicación en el uso de las endonucleasas de restricción que no haya sido explicada en este módulo.
Ejemplo: Mapa de restricción
Como interpretarlo
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