Objetivos Luego de haber completado el ejercicio, el (la) estudiante estará capacitado para: Explicar las funciones de las endonucleasas de restricción. Especificar las ventajas de las endonucleasas de restricción cuando son utilizadas para el estudio del DNA. Enumerar las diversas aplicaciones en el uso de las endonucleasas de restricción. Crear y analizar patrones polimórficos de endonucleasas de restricción.
Trasfondo En los últimos años la biología molecular ha revolucionado el estudio de los ácidos nucleicos, en particular el DNA. El conocimiento de la estructura del DNA y el desarrollo de la tecnología de DNA recombinante han permitido la manipulación del material genético en cualquier tipo de célula. La tecnología de manipulación genética ha sido aplicada desde bacterias hasta organismos eucariota (e.j. tomate, maíz y peces). La manipulación genética se ha logrado en gran parte por el uso de las endonucleasas de restricción.
Endonucleasas A. Endonucleasas de restricción. Enzimas que reconocen una secuencia específica de nucleótidos y producen un corte en el lugar de reconocimiento o muy cerca del mismo.
Las bacterias poseen las endonucleasas de restricción como un sistema enzimático de defensa en contra de la invasión de DNA exógeno, como por ejemplo; el ataque de un bacteriófago.
E coli vs H. influenza Descubiertas por Stewart Lynn y Werner Arber en 1960 en la bacteria Echerichia coli. Se speraba que esta cortara cualquier DNA en una secuencia de nucleótido específico No ocurrió como ellos esperaban, la enzima no cumplió con sus expectativas. Más adelante, Hamilton Smith descubrió una endonucleasa de restricción en la bacteria Haemophilus influenza sepa Rd (figura 1), llamada HindII.
Nomenclatura La primera letra del nombre de la enzima proviene del género
Las próximas dos letras de la especie
La cuarta letra de la sepa.
El número romano hace referencia a la cantidad de endonucleasas de restricción que han sido extraídas de la misma bacteria. Ejs. HindI, HindII y HindIII.
Reconocimiento La secuencia de reconocimiento para la mayoría de estas endonucleasas de restricción contiene de 4 a 6 y hasta 8 nucleótidos. Esta secuencia de reconocimiento exhibe una simetría palindrómica, lo que quiere decir, aunque no implica eso, que lee lo mismo de” izquierda a derecha que de derecha a izquierda”. Ejemplo: 5’ GGGCCC 3’ 3’ CCCGGG 5’
Frecuencia de reconocimiento Las enzimas que reconocen una secuencia de 4 bases, cortan con más frecuencias que las que reconocen una secuencia de 6 bases
La frecuencia esta determinada por la probabilidad:
Una secuencia de 4 bases tiene la probabilidad de ocurrir en un genoma cada 256 pb (44 = 256) Una secuencia de 6 bases tiene la probabilidad de ocurrir en un genoma cada 4,096 pb (46 = 4096). Una secuencia de 8 bases tiene la probabilidad de ocurrir en un genoma aproximadamente cada 65,000 pb (48 ˜ 65,000).
Endonucleasas: Isoesquisomeros Enzimas que reconocen la misma secuencia pero cortan en lugares distintos del mismo palindrome
Ejemplo: XmaI C?CCGGG SmaI CCC?GGG
Endonucleasas y Palíndromes. La flecha indica el lugar donde la enzima corta el DNA.
Endonucleasas: Tipos de Cortes Terminales truncados: enzimas cortan ambas hebras del DNA en el mismo punto (HaeIII) Terminales pegajosos: enzimas que cortan las hebras de DNA en una forma escalonada, dejan fragmentos con cierta capacidad de complementaridad (EcoRI) el fragmento sencillo de la hebra pueden parearse a través de enlaces de hidrógenos a las bases de otro fragmento sencillo generado por la misma enzima. Estas ultimas son usadas para crear moléculas de DNA recombinante (ver aplicaciones de endonucleasas de restricción).
Extremos: truncados vs pegajosos
Enzimas de Restricción: Metilación B. Metilación y actividad de las endonucleasas de restricción Las bacterias poseen un sistema para proteger su propio DNA de la digestión por parte de sus endonucleasas de restricción, o sea reconocen su propio DNA del DNA exógeno. Las bacterias poseen en su DNA unas bases metiladas que no le permiten a la endonucleasa reconocer la secuencia donde corta.
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