Susceptibilidad a Insecticidas y Actividad Enzimática de Cydia pomonella L. proveniente de Tres Huertos de la Región del Maule, Chile (página 2)

MATERIALES Y MÉTODOS

Huertos. En el estudio se utilizaron huertos de manzanos (Malus sylvestris var. domestica) ubicados en las localidades de Teno (34°53’ lat. Sur), Molina (35°8’ lat. Sur) y Panguilemo (35°29’ lat. Sur). Estos tres huertos se seleccionaron debido a que, pese a recibir aplicaciones de insecticidas, presentaban antecedentes de daño por polilla de la manzana en frutos a cosecha de aproximadamente 3-5% en la temporada anterior. El huerto de Molina tiene manzanos variedad Royal Gala, con programas de manejo que incluían aplicaciones por calendario de organofosforados y tebufenozide. El huerto de Teno tiene manzanos variedad Granny Smith, con aplicaciones de organofosforados por calendario Finalmente, el huerto de Panguilemo tiene manzanos variedad Red Chief destinados a producción de jugo, con una o dos aplicaciones de organofosforados por temporada.

Insectos. Durante diciembre 2001 y enero de 2002 se instalaron trampas de cartón corrugado en los huertos estudiados, de las cuales se recolectaron posteriormente (marzo-abril 2002) larvas en diapausa de C. pomonella (Sauphanor et al., 1999; 2000; Boivin et al., 2001). Las larvas se sacaron de las trampas y se reubicaron en bandas de cartón corrugado en potes plásticos, para cumplir dos meses a 2 ± 1°C y fotoperíodo L12:O12 (Sauphanor et al., 2000; Boivin et al., 2001). Una vez cumplido el período de frío y para inducir el término de la diapausa, las larvas se transfirieron a 22 ± 1°C y fotoperíodo largo (L16:O8). Un día después las larvas se separaron por sexo y se sometieron al bioensayo con insecticidas (Boivin et al., 2001). Como cepa susceptible de referencia (S) se usaron larvas mantenidas por más de 20 años bajo crianza masiva en laboratorio.

Bioensayos. Para cada uno de los bioensayos se prepararon soluciones en acetona de los productos técnicos azinfos metil (93% de ingrediente activo, Bayer AG) y tebufenozide (97% de ingrediente activo, Rohm and Hass). Se estudió el efecto de dosis diagnóstica de 400 mg kg-1 azinfos metil y de 300 mg kg-1 de tebufenozide, correspondientes a la concentración letal para el 99% (LC99) de la cepa susceptible de laboratorio, utilizando 40 larvas por localidad para la evaluación de cada insecticida. Se hizo una aplicación tópica de 1 m L de las soluciones insecticidas con una micropipeta repetitiva ajustable (Gilson Ò T2, Middleton, Wisconsin, EE.UU.) en la región dorsal media de las larvas. Además, sobre un grupo de igual número de larvas de cada localidad (40 larvas), se aplicó un volumen de 1 m L de solvente puro, como tratamiento control para estimar el posible efecto tóxico de éste. Inmediatamente después del tratamiento, las larvas se transfirieron a placas Petri de 90 mm de diámetro, en cuyo interior se depositaron trozos de cartón corrugado (20 x 20 mm). Las larvas se incubaron a 25 ± 1°C, 40 ± 10% de HR y fotoperíodo largo (L16:O8). Las placas se observaron a diario hasta la emergencia de la última polilla, la mortalidad se anotó en términos de adultos no emergidos (Sauphanor et al., 2000).

Determinación de actividad enzimática. La actividad de GST, OFM y EST se evaluó en adultos emergidos de cada huerto (Bush et al., 1993). Las mediciones de actividad de GST y OFM se efectuaron mediante fluorimetría, y la de EST por cambios de absorbancia. En ambos casos, se utilizó un lector de microplacas (Perkin Elmer, HTS 7000, Wellesley, Massachussets, EE.UU.).

Preparación de extractos enzimáticos. Para los análisis de actividad de GST y EST, se disectaron los abdómenes de las polillas y se homogeneizaron individualmente en 150 m L de buffer Hepes 50 mM (pH 7,0) (Nauen y Stumpf, 2002). Luego, se centrifugaron por 15 min a 4°C y 15.000 g, usando el sobrenadante como fuente de enzima (Bouvier et al., 2002).

Glutation-S-transferasas. La actividad de GST se determinó usando monoclorobimano (MCB) como sustrato en microplacas negras de 96 celdas, de acuerdo a Nauen y Stumpf (2002), con modificaciones en los volúmenes de extracto utilizado. En cada celda se incluyeron 30 m L de extracto enzimático (equivalente a 0,2 abdomen), 168 m L de glutation reducido 100 mM (GSH) en buffer Hepes 50 mM y 2 m L de MCB 30 mM. Para los controles se utilizó buffer en lugar de extracto enzimático. La placa se incubó a 22°C por 20 min, luego de los cuales se midió la fluorescencia a 380 nm de excitación y 465 nm de emisión. Como el complejo GSH-bimano no está disponible comercialmente, los resultados se expresaron en unidades de fluorescencia insecto-1 (Nauen y Stumpf, 2002).

Esterasas. La actividad de esterasas totales se midió en microplacas, usando b -naftil acetato como sustrato (Bush et al., 1993; Bouvier et al., 2002). A cada celdilla con buffer fosfato 50 mM (pH 6,5) más 0,1 mM b naftil acetato (Bouvier et al., 2002), se agregaron 0,5 m L de extracto enzimático más 89,5 m L de buffer Hepes 50 mM (pH 7,0). Esta reacción se incubó a 30°C por 15 min, luego de los cuales se detuvo agregando 20 m L de una solución reactiva compuesta por 3 g L-1 de 1-naftillamina (Fast Garnet) y 35 g L-1 de sodio dodecil sulfato. Doce celdas con buffer de extracción en lugar de enzima se usaron como control. La absorbancia del complejo Naftol-Fast Garnet, se midió después de 15 min a 490 nm (Bouvier et al., 1998, 2002). La concentración de proteína en las suspensiones se estimó a través del método de Bradford (1976).

Oxidasas de función múltiple. La actividad de OFM en tejido intacto, se determinó a través de la actividad de 7-etoxicumarina-O-desetilación (ECOD) (De Sousa et al., 1995). Para ello, los abdómenes disectados de los insectos se dispusieron individualmente en celdas de microplacas negras, con 100 m L de buffer fosfato 50 mM (pH 7,2) y etoxicumarina 0,4 mM. En el caso de los controles, se agregó el mismo volumen de buffer glicerina/etanol (v/v) (10-4M), para evitar la reacción. Después de 4 h de incubación a 30°C, se detuvo la reacción agregando 100 m L de buffer. En los controles se agregó el mismo volumen de buffer glicerina/etanol (v/v) (10-4M), para evitar la reacción. Finalmente, se midió la fluorescencia de las muestras a 380 nm de excitación y 465 nm de emisión (Bouvier et al., 1998).

Análisis de resultados. Los promedios de mortalidad total y por sexo de las larvas de cada huerto, se compararon entre sí y con la cepa de referencia a través de la prueba de G (Sokal y Rohlf, 1995). Los resultados se presentan corregidos por la mortalidad asociada a la aplicación del solvente con la fórmula de Abbott (1925). Las actividades de GST y EST se sometieron a un ANDEVA, y para detectar diferencias entre las poblaciones se realizó la prueba de separación de medias de Fisher (FPLSD) con significación del 5%. Debido a que la actividad de OFM no cumplió todos los supuestos del ANDEVA, se efectuó la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis con significación del 5% (Sokal y Rohlf, 1995).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Eficiencia de los insecticidas. La mortalidad de las larvas de las localidades de Molina (30%) y Teno (85,4%) frente a la dosis diagnóstico de azinfos metil fue significativamente menor a la de la cepa control (95,6%), mientras para tebufenozide sólo la mortalidad de las larvas de Molina resultó estadísticamente diferente (35,1%). Las larvas de Panguilemo no presentaron diferencias significativas de mortalidad con la cepa S para azinfos metil ni tebufenozide (Cuadro 1). La menor susceptibilidad de las larvas de Molina puede deberse a que los programas de manejo de este huerto, incluyeron varias aplicaciones de tebufenozide y organofosforados durante las tres temporadas anteriores. En el huerto de Teno sólo se aplicaron organofosforados, lo que concuerda con su menor sensibilidad a azinfos metil y con su similar susceptibilidad con la cepa de laboratorio a tebufenozide. Finalmente, Panguilemo, por ser un huerto para la producción de fruta para jugo, recibió una aplicación mínima de insecticidas (normalmente sólo una o dos aplicaciones de organofosforados), lo que se relacionó con sus altos niveles de susceptibilidad a insecticidas detectados en los bioensayos.

Cuadro 1. Susceptibilidad a concentraciones diagnósticas de insecticidas de larvas en diapausa de una cepa de laboratorio susceptible a insecticidas (S) y tres poblaciones de campo de Cydia pomonella. Table 1. Susceptibility to diagnostic insecticide concentrations in diapausing larvae of an insecticide-susceptible laboratory strain (S) and three field populations of Cydia pomonella.

Letras distintas en la misma columna indican diferencias significativas según prueba de G (p < 0,05). a Mortalidad corregida por fórmula de Abbott (1925).

Estudios previos indicaron fuertes diferencias de sensibilidad entre poblaciones de C. pomonella tratadas y no tratadas con insecticidas (Varela et al., 1993), con una mayor susceptibilidad en polillas provenientes de huertos con programas de aplicaciones irregulares y poco frecuentes (Chapman y Barrett, 1997). Knight et al. (1994) encontraron una fuerte asociación entre los niveles de resistencia a azinfos metil expresados por las polillas y la presión de selección; éstos fueron claramente superiores en huertos con más de cuatro aplicaciones de organofosforados por temporada. En C. pomonella, Sauphanor y Bouvier (1995) describieron resistencia cruzada de tebufenozide con diflubenzuron en dos poblaciones francesas que no habían sido previamente tratadas con tebufenozide u otra benzidrazina. Adicionalmente, cepas de laboratorio resistentes a deltametrina y diflubenzuron, resultaron resistentes también a tebufenozide (Sauphanor et al., 1999).

Efecto del sexo en la susceptibilidad a insecticidas. En algunas localidades se observaron diferencias en la susceptibilidad de las larvas dependiendo del sexo del individuo tratado, pero éstas no fueron estadísticamente significativas. En las larvas de Molina, la susceptibilidad frente a azinfos metil y tebufenozide fue menor para los machos, al igual que para las larvas de Teno frente a tebufenozide. Sin embargo, la mortalidad registrada frente a azinfos metil por larvas de esta localidad y de la cepa de referencia frente a ambos insecticidas fue menor en las hembras (Cuadro 1). La mortalidad de cada sexo presentó diferencias significativas similares a la mortalidad del total de las larvas evaluadas, con las excepciones de los machos de Teno frente a azinfos metil y de Molina frente a tebufenozide.

Al analizar individuos adultos mediante la aplicación tópica de azinfos metil, Varela et al. (1993) detectaron LC50 1,3 veces mayores para las hembras. Si bien esa diferencia no fue significativa, los autores propusieron que esta tendencia a una menor susceptibilidad de las hembras podría deberse a su mayor tamaño corporal en relación con los machos. En forma concordante, Sauphanor et al. (2000) observaron una menor emergencia de adultos machos luego de su tratamiento con concentraciones diagnóstico (LC99= 10 mg L-1) de deltametrina.

Actividad de enzimas detoxificadoras

Glutation-S-transferasas. La actividad de GST encontrada en las poblaciones de polilla de Molina y Teno fue significativamente superior a la de la cepa S (F(3,193) = 8,09, p < 0,0001) (Cuadro 2), con promedios de 1,55 y 1,62 veces la actividad de la cepa de referencia, respectivamente. Por el contrario, los individuos de Panguilemo presentaron una actividad similar a la de la cepa de referencia (Cuadro 2). No hubo diferencias de actividad de GST entre machos y hembras (p ³ 0,05).

Cuadro 2. Actividad in vitro de enzimas glutation-S-transferasas (GST) y esterasas (EST) en adultos de una cepa de laboratorio susceptible a insecticidas y tres poblaciones de campo de Cydia pomonella. Table 2. In vitro activity of the enzymes glutation-S-transferase (GST) y esterase (EST) in adults of an insecticide-susceptible laboratory strain and three field populations of Cydia pomonella.

a Letras distintas en la misma columna indican diferencias estadísticas según prueba de Fisher (p < 0,05)

Estos resultados sugirieron que las enzimas GST podrían estar asociadas a la reducción de susceptibilidad frente a azinfos metil en las larvas de Molina y Teno, así como frente a tebufenozide en las larvas de Molina (Cuadro 1). Estas enzimas participan normalmente en la metabolización de compuestos endógenos, pero se ha descrito que también pueden detoxificar varios grupos químicos de insecticidas (McKenzie, 1996; Souderlund, 1997; Nauen y Stumpf, 2002). Previamente, Sauphanor et al. (1997) y Bouvier et al. (2002) detectaron un significativo incremento en la actividad de GST en poblaciones de polilla de la manzana resistentes a diflubenzuron y deltametrina, en comparación con una población susceptible.

Esterasas. El ANDEVA indicó que la actividad de EST en los adultos de todas las localidades fue estadísticamente inferior a la expresada por la población de referencia (F(3,193) = 3,42, p < 0,0183) (Cuadro 2). No hubo diferencias de actividad de EST entre machos y hembras (p ³ 0,05).

Al comparar la actividad de EST en larvas de segundo estadío de cepas resistentes a deltametrina y diflubenzuron, con la misma cepa S utilizada en este estudio, Bouvier et al. (2002), obtuvieron resultados similares con razones de resistencia/susceptibilidad (R/S) de 0,49 y 0,57, respectivamente. Para los demás estadíos, no observaron variación, situación ya observada por Sauphanor et al. (1997, 1999) al analizar larvas de último estadío. Bush et al. (1993) encontraron una correlación negativa entre sobrevivencia a paration y actividad de EST, sugiriendo que la resistencia a este organofosforado involucraría la participación de una esterasa modificada. Sin embargo, al usar un inhibidor de estas enzimas (S,S,S-tributil fosforotritioato), Sauphanor et al. (1997) observaron incrementos en la toxicidad frente a deltametrina tanto en la cepa susceptible como en la resistente. Este sinergismo en larvas de ambas cepas indicaría que si bien las EST se encuentran implicadas en la metabolización de ciertas moléculas, no serían responsables de la resistencia a los insecticidas evaluados.

Oxidasas de función múltiple. Los adultos de Teno y Molina presentaron una actividad de OFM significativamente mayor que los de Panguilemo y la cepa susceptible de referencia (H(3,299) = 17,34, p < 0,0006) (Cuadro 3).

Cuadro 3. Actividad in vivo de enzimas oxidasas de función múltiple (OFM) en adultos de una cepa de laboratorio susceptible a insecticidas y tres poblaciones de campo de Cydia pomonella. Table 3. In vivo mixed-function oxidase (OFM) enzyme activity in adults of an insecticide-susceptible laboratory strain and three field populations of Cydia pomonella.

Promedios con letras distintas en la misma columna indican diferencias significativas según prueba de Kruskal Wallis (p < 0,05). a pg: picogramos. b R/S (resistencia/susceptibilidad): Tasa de actividad de población analizada y población susceptible. c No corresponde calcular relación.

Los rangos de actividad observados en este estudio fluctuaron entre 0 y 192,5 picogramos (pg) 7OH insecto-1 min-1 (Cuadro 3). Sauphanor et al. (1997) observaron que el valor máximo expresado por larvas de una cepa susceptible de referencia fue 100 pg 7OH insecto-1 min-1, mientras que en una población natural de adultos susceptibles, éste sólo alcanzó 68 pg 7OH insecto-1 min.-1 (Boivin, T. 2002. Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), Francia. Comunicación personal). Los valores de actividad de OFM presentados por larvas de poblaciones europeas resistentes a diflubenzuron, tebufenozide y deltametrina, fueron siempre superiores a los encontrados en las susceptibles, con tasas R/S que varían entre 3,8 y 65,07 (Bouvier et al., 1998, 2002; Sauphanor et al., 1998, 1999; Boivin et al., 2003. La actividad media de OFM de las polillas de las localidades estudiadas no superó el máximo señalado para adultos de la población europea susceptible de campo. Sin embargo, algunos de los individuos analizados superaron este valor de referencia (Figura 1), lo que sugeriría que estas enzimas podrían constituir un mecanismo de resistencia emergente en poblaciones chilenas de C. pomonella. 

Figura 1. Distribución de la actividad in vivo de oxidasas de función múltiple (OFM) entre adultos de una cepa de laboratorio susceptible a insecticidas y tres poblaciones de Cydia pomonella colectadas en el campo. Figure 1. Distribution of the in vivo mixed-function oxidase (OFM) activity among adults of an insecticide-susceptible laboratory strain and three field population of Cydia pomonella.

Se observaron diferencias significativas en la actividad de OFM entre sexos, que fue mayor para las hembras de Molina, Teno y Panguilemo (H(3,182) = 12,43, p < 0,0061) (Cuadro 4). Al comparar las poblaciones por sexo, no se observaron diferencias significativas en el caso de los machos (H(3,120) = 5,22, p = 0,1563) (Cuadro 4), pero sí para las hembras (H(3,182) = 12,43, p = 0,0061), lo que corrobora los resultados presentados para el total de las polillas estudiadas (Cuadro 3).

Cuadro 4. Actividades in vivo de oxidasas de función múltiple (OFM) tanto para hembras y machos adultos de una cepa de laboratorio susceptible a insecticidas y tres poblaciones de campo de Cydia pomonella. Table 4. In vivo mixed-function oxidase (OFM) activity in both female and male adults of an insecticide-susceptible laboratory strain and three field populations of Cydia pomonella.

Letras minúsculas distintas en la misma fila y mayúsculas distintas en la misma columna indican diferencias significativas según prueba de Kruskal Wallis (p < 0,05). a picogramos. b Valores promedio de actividad de OFM. c Resultados de Kruskal Wallis para cada población.

La mayor actividad de OFM en las polillas provenientes de Molina coincidió con la baja susceptibilidad de sus larvas frente a azinfos metil y tebufenozide. La menor susceptibilidad a azinfos metil, pero no a tebufenozide de las larvas de Teno, podría también estar relacionada con la actividad de OFM. Esta actividad fue, por lo general, mayor en las hembras que en los machos, lo que también coincidió con la menor susceptibilidad observada generalmente en las hembras. Por lo tanto, sería posible que la acción de estas enzimas contribuya a la degradación de estos insecticidas en las poblaciones mencionadas, lo que podría resultar en individuos resistentes a la acción de estos productos (Sauphanor et al., 1998).

CONCLUSIONES

Larvas en diapausa de polilla de la manzana recolectadas en Molina y Teno, presentaron baja susceptibilidad a azinfos metil y tebufenozide, lo que sugeriría la presencia de niveles detectables de resistencia a insecticidas en algunos huertos de la Región del Maule.

Considerando los resultados de actividad de enzimas detoxificadoras, las glutation-s-transferasas y oxidasas de función múltiple podrían estar involucradas en los niveles de resistencia a azinfos metil y tebufenozide observados.

LITERATURA CITADA

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Maritza Reyes1, Jean Charles Bouvier2, Thomas Boivin3, Eduardo Fuentes-Contreras1, y Benoît Sauphanor2 1 Universidad de Talca, Facultad de Ciencias Agrarias, Casilla 747, Talca, Chile. 2 Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), Ecologie des Invertébrés, Site Agroparc 84914, Avignon.