Colonización de la raíces de frijol Phaseolus vulgaris L. por aislados nativos de Rhizobium etli

Colonización of the Root System of Phaseolus vulgaris L.By Indigenous isolates of Rhizobium etli.

2. Resumen
3. Introducción y antecedentes
4. Materiales y métodos
5. Resultados y discusión
6. Conclusiones

RESUMEN

La dinámica de la colonización de la espermosfera- rizosfera de tres variedades de fríjol (Phaseolus vulgaris L.): Negro Jamada, Canario y Flor de Mayo, por dos cepas nativas de Rhizobium etli, se analizó en suelo no estéril en sistema de jarras de Leonard.

Los resultados no mostraron diferencias estadísticas en la dinámica de colonización entre los aislados, ni entre las variedades de fríjol, lo que sugirió un efecto espermósfera-rizósfera positivo sobre los aislados y un intercambio de señales químicas de reconocimiento entre Rhizobium y la leguminosa. Lo cual coincidió con el elevado porcentaje de ocupaciones de los nódulos encontrados en las variedades.

La ssuperviviencia de las dos aislados de R.etli en el suelo fue semejante, limitada principalmente por la ausencia del sistema radical de la planta, lo que sugiere una dependencia de la bacteria por los exudados de la espermósfera-rizósfera del fríjol para supervivir y crecer.

Palabra clave: Colonización, Exudados, Espermosfera-rizosfera, Fríjol, Nódulos, Rhizobium, Sobrevivencia.

SUMMARY

The colonization dynamics of spermosphere-rizosphere of three common bean varieties: Negro Jamapa, Canario, and Flor de Mayo by two indigenous strains of Rhizobium etli was analized under non sterile soil condition in the Leonard´s jar system.

Results suggest that not statistical difference was observed between the two indigenous isolates of R. etli on its colonization dynamics on the three common beans varieties or neither among these, which indicated a positive effect spermosphere-rizosphere on the isolates, also an exchange chemicals recognition signals in coincidence with its high occupancy per cent in the nodules on the varieties.

The R etlis´s survival of the isolates was similar in soil. Limited mostly by the absence of the root system of the plant, suggesting that R etli depends on the spermosphere-rizosphere exudates of common bean its survival and growth.

Index words: Colonization, Exudates, Spermosphere-rizosphere, Common bean, Nodules, Rhizobium, Survival.

INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES

La inoculación de leguminosas con especies de Rhizobium es una alternativa agrícola para reducir elevadas dosis de fertilización nitrogenada e incrementar su rendimiento (Somasegaran y Hoben, 1985; Vincent, 1970). Sin embargo, en ocasiones la planta no muestra los beneficios esperados, en parte por la incapacidad de competencia de las cepas de Rhizobium usadas en su inoculación; primero en el ambiente del suelo, luego en la espermósfera o zona de influencia de la semilla en germinación, la cual produce las primeras señales químicas de intercambio planta-Rhizobium (Brewin, 1991; Dazzo y Gardiol, 1984; Dénarie et al., 1992) para iniciar la colonización de la raíz, la cual se continuará y estimulará por los productos liberados en la interfase suelo-rizosfera o sistema radical durante la floración cuando la planta alcanza una intensa actividad biológica.

Este proceso dinámico no concluirá, sino hasta la muerte de la planta en la senectud (Araujo et al., 1994, Curl y Truelove, 1986; Kloepper et al., 1991).

Por lo tanto es comprensible que por razones naturales el reconocimiento de estas señales químicas para la población de Rhizobium autóctona del suelo, le confiera ventajas sobre las que se introducen (Meade et al., 1985; Singleton y Tavares, 1986).

Una solución que ha sido planteada (Woomer et al., 1988ª, 1988b), pero no estudiada lo suficiente (Dughri y Bottomley, 1984; Moawad et al., 1984), es la de seleccionar cepas autóctonas con alta con alta capacidad de competencia, en lugar de introducir cepas que, aunque competitivas, provienen de nódulos o suelos ajenos al sitio en cuestión, debido a la determinante influencia de la población de Rhizobium autóctono del suelo sobre la respuesta de la leguminosa a la inoculación con cepas introducidas (Thies et al., 1991ª 1991b).

En esta investigación se emplearon dos aislados autóctonos de R. etli del municipio de Zaragoza, Coah. Estas cepas se evaluaron en campo y causaron una respuesta positiva en fríjol, en términos de peso seco y rendimiento, comparada con diferentes niveles de fertilización nitrogenada y con un inoculante comercial. El objetivo de este trabajo fue analizar la dinámica de colonización de la espermósfera-rizósfera de tres variedades de fríjol (Negro Jamada, Canario y Flor de mayo) por dos aislados autóctonos de R. etli.

Materiales y métodos

Características fisicoquímicas del suelo usado.

Se usó un suelo agrícola del municipio de Apodaca, N.L., México con propiedades fisicoquímicas muy semejantes a las de suelos de Zaragoza, Coah.; N total 0.07% (Kjeldahi), materia orgánica 1.28% (Walkley-Black), textura arcillosa (hidrómetro de Baouyoucos), pH 70 (potenciómetro) y humedad 30% de acuerdo con SCS-USDA (1984).

Aislados nativos de R.etli

Los aislados de R. etli (previamente llamado Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli ), denominadas como G-2 y Z-9, con diferente marca genética: G-2 resistente a estreptomicina (S) (Lakeside) 1000 µg/mL y Z-9, resistente a 1000µg/mL diazinón (D) (Diazitox 25-E. 0,0-Dietilo-2 Isopropil-4-Metil-Pirimidil-6-fósforotioato. Química del Golfo).

Estas sustancias se usaron para su recuperación y diferenciación adicionada al agar extracto levadura manitol con rojo congo (AELMRC) g/L: manitol 10.0., K2HPO4 0.5., MgSO4. 7H2O 0.2., NaCl 0.1., extracto de levadura 1.0., rojo congo 10.0 mL (solución 1:400), pH 7.0, agar 18.0.

Preparación de las jarras de Leonard y variedades de fríjol.

El experimento se realizó en condiciones de invernadero en jarras de Leonard con 3.5 kg del suelo de Apodaca, Nuevo León, México Las tres variedades de fríjol probadas fueron: Negro Jamapa, Canario y Flor de May. Las plantas se alimentaron con la solución de White: KH2PO4 1 M-1 ml., CaCl2 2H2O 1 M-1 mL, FeSO4 trazas; solución de elementos menores: H3BO4-2 68 g; ZnSO4 7H2O-0 22 g; KCl-0 09 g, NAMoO4- trazas, agua destilada 100 ml, pH 7.0), 1 mL agua destilada 100mL, pH 7.0, 1 ml de agua destilada-1000 ml, con la adición de NH4NO3 1M, 5 mL/1, para el frijl usado como control con N.

Análisis estadístico del diseño experimental.

Se empleó un diseño estadístico de bloques al azar, con cuatro repeticiones por intervalo de muestreo y seis tratamientos: T-1 = variedad (var.) Canario inoculada (inoc) con G-2; T-2 = var. Canario inoc. Con Z-9; T-3 = var. Flor de Mayo inoc. Con Z-9; T-5= var. Negro Jamada inoc con G-2; T-6=6 var. Negro Jamada inoc con Z-9 y los controles con y sin N con un análisis de varianza (ANOVA): modelo I trifactorial.

Manejo de los aislados nativos.

Los aislados de Rhizobium se activaron en caldo extracto levadura manitol (CELM) por 30 h a 28°C, lavadas tres veces en solución salina 0.85%. Se utilizó 1 x 104 rhizobios/mL con el nefelómetro de Mc Farland, corroborado por cuenta viable (CV) en el AELMRC

Dinámica de colonización de los aislados de R etli en fríjol.

El experimento se inició con la siembra de cinco semillas por jarra de cada variedad, cada semilla se inoculó con 1 x 104 R etli/mL, las jarras se mantuvieron en invernadero durante 50 días. En cada intervalo de 0, 3, 6, 10, 15, 20, 30, 40 y 50 días después de la siembra de los dos tratamientos se consideró una serie de jarras, y se extrajo según el caso de 0.5 g a 1 g de/principio de raíz, raíces antes de la nodulación, raíces-nódulos durante la floración y al final raíces-nódulos en lisis, para suspender en matraces de de 25 mL con 12 mL de solución salina y agitar a 250 rpm por 30 min. De la suspensión se realizaron diluciones seriadas en solución salina y de la 10-4, 10-5 y 106. Se tomó 0.25 mL para sembrar por triplicado en cajas con AELMRC con S o D.

Las cajas se incubaron por cinco días a 28°C, para determinar el promedio del logaritmo del numero de unidades formadoras de colonias (UFC) de las cuatro repeticiones/f de espermosfera (considerada así, de la siembra de semilla al primordio de raíz) y rizosfera (desde el desarrollo normal del sistema radical a la lísis total de los nódulos).

Determinación del por ciento de nódulos formados por los aislados nativos.

Durante la floración aproximadamente 45 días después de la siembra, se determinó el porcentaje de nódulos formados por los aislados autóctonos de R.etli en las variedades de fríjol. Para ellos se trituraron 100 nódulos obtenidos de las cuatro repeticiones de cada tratamiento en cajas con AELMRC y (S) o (D). Las cajas se incubaron por cinco días a 28°C, según descripción de Somasageran et al., (1981).

Supervivencia de los aislados en el suelo.

En este experimento se utilizó un diseño estadístico de bloques al azar con dos tratamientos: T-1= suelo inoculado con el aislado de R.etli G-2; T-2= suelo Z-9, y tres repeticiones, para lo cual porciones de 50 g del suelo de Apodaca, N.L. se colocaron en recipientes de aluminio y se mantuvieron a una humedad de 60% de la capacidad de campo, a temperatura de 28°C. La determinación del logaritmo promedio de las UFC de los aislados de R.etli de suelo seco, se realizó como sigue: se tomaron 2 g de suelo en cada intervalo (0, 6, 9, 12 y 15 días) y sus repeticiones, para suspender en matraces de 50 mL con 20 mL de solución salina y se realizaron disoluciones de las cuales se usaron la 10-2 y 10-3, se tomó 0.25 mL de cada una para sembrar en cajas con AELMRC S o D, por triplicado, se incubaron por 5 días a 20°C.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Dinámica de la colonización de los aislados nativos de R.etli en el fríjol.

La figura 1 muestra la dinámica de colonización de las dos aislados autóctonos de R.etli en la espermósfera-rizosfera de la variedad de fríjol Negro Jamapa. Se observó un efecto positivo estimulatorio de la espermosfera sobre ambas poblaciones de ambos aislados (Dazzo y Gardiol, 1984), desde los primeros días de la germinación de la semilla hasta el sexto día, cuando alcanzaron su máxima densidad de población; después se detecto una drástica caída en la densidad de la población del aislado de R.etli G-2, lo cual sugiere que durante el desarrollo del primordio de raíz a raíces verdaderas se incrementó la actividad fisiológica de la planta y se liberaron otra clase de exudados, que fueron utilizados con mayor eficacia y rapidez por poblaciones autóctonas del suelo, que por este aislado nativo de R.etli (Lowndorf, 1981; Moawad et al., 1994).

Un comportamiento diferente se observó en la población del aislado de R.etli Z-9, la cual mostró una mejor capacidad de competencia y utilización del nuevo tipo de exudados de la espermosfera-rizosfera del fríjol, esto sugiere una respuesta fisiológica distinta entre los aislados de R. etli a exudados radicales liberados durante etapas especificas del ciclo del biológico de la planta (Bergman et al., 1988; Brewin, 1991).

Sin embargo, en el día 30 ambas aislados nativos mostraron la misma densidad poblacional, esta disminución parece ser su adaptación a las nuevas señales químicas del sistema radical, las cuales de momento fueron mejor reconocidas por las poblaciones del suelo antagonista a los aislados nativos de R.etli (Dénarie et al., 1992; Halverson y Stacey, 1986), para que luego cambios en el tipo de señales químicas de reconocimiento entre la bacteria y la rizósfera de la variedad, les permitió recuperar el dominio de la zona (Huntetr y Fahring, 1980; Long, 1989) y, como consecuencia, alcanzar un alto porcentaje de nódulos examinados, como lo muestra el Cuadro 2.

Estos resultados sugieren que la selección de aislados autóctonos de R.etli (individualmente o en mezcla), mediante el análisis de su dinámica de colonización puede servir como herramienta para la selección adecuada de los aislados que respondan a las expectativas planeadas con una variedad de fríjol especifica (Aviado et al., 1990; Beattie et al; 1989).

La figura 2 presenta la dinámica de colonización de los autóctonos de R.etli en la espermosfera-rizosfera del fríjol var. Canario. En ella se observa que a diferencia de la var. Negro Jamapa, los exudados de la espermosfera de la var. Canario estimularon selectivamente el incremento en la densidad de la población del aislado de R.etli G-2 (Meade et al., 1985; Yao y Vincent, 1969), pues al tercer día el logaritmo de la UFC de la G-2 fue de casi 6.0, inferior al de la Z-9 (4 8).

Entre el sexto y vigésimo noveno día, los exudados de la rizosfera favorecieron una densidad de la población de ambos aislados con pocas fluctuaciones, aunque con una tendencia de la densidad de ambos poblaciones a disminuir de la cantidad original inoculada en las semillas de fríjol. Esto sugiere algún mecanismo regulazación de la población del microambiente, controlado por la planta (Schubert, 1986; Van Brussel et al., 1986).

En el día 30 se detectó la densidad mas baja de los aislados, lo que, como se señaló, fue causado por el cambio en el patrón de exudados radicales (Imsande, 1981, Long, 1989) que favorecieron mas la actividad antagonista de los microorganismos autóctonos del suelo, similares y diferentes de Rhizobium (Hunter y Fahring, 1980; Maede et al., 1985; Moaward et al., 1884).

Posteriormente, como se mostró antes, los aislados recuperaron el dominio de la rizosfera, lo que sugiere que tienen una mayor capacidad de reconocimiento de las señales químicas de los exudados radicales de la variedad, que les permite ser más competitivas en la utilización de los exudados, no solo de otros rhizobios, sino también de microorganismos totalmente distintos.

Lo anterior coincidió con el alto porcentaje (G-2=71% y Z-9=70%) de ocupación en los nódulos de las raíces de esta variedad (Araujo et al., 1985), lo que se señala en el Cuadro 2. esto también sugiere una estrecha relación de especificidad de reconocimiento entre los aislados nativos de R.etli y la variedad de fríjol (Carlson, 1982; Carlson et al., 1987; Dazzo y gardiol, 1984) que puede favorecer una respuesta positiva de la leguminosa a la inoculación (Dowling y Broughton, 1986; Ham et al., 1971; Hunter y Fahring, 1980).

En la figura 3 se muestra la dinámica de la colonización de los aislados nativos de R.etli en la espermósfera-rizósfera de la var. Flor de Mayo. La que en principio fue semejante hasta antes de la floración, esto sugiere que durante este periodo los aislados fueron altamente competitivas, utilizaron el tipo de exudados liberados por espermosfera-rizósfera. Mientras que el cambio de señales químicas de los exudados radicales afectaron negativamente la capacidad infectiva del aislado G-2 (Caetano-Anolles, 1988; Halverson y Stacy, 1986, Imsande, 1981) y estimularon la competencia autóctona del suelo (Kloepper et al., 1986) contra este aislado, lo cual se reflejó en el bajo porcentaje (50%) de ocupación en los nódulos de esta variedad, comparado con las otras (Cuadro 2).

Cuadro 1. Análisis de varianza de la colonización de dos aislados nativos de Rhizobium etli inoculados en tres variedades de fríjol.

A=variedad de fríjol B= aislados o cepas IAxB= Interacción variedad-aislado (cepa) a50 días después de la siembra

El aislado Z-9 aparentemente no fue afectada, pues alcanzó un alto porcentaje de ocupación en los nódulos (71%), lo que sugiere que durante la floración, a nivel radical, se suceden cambios de señales químicas de reconocimiento con el aumento de la actividad biológica vegetal (Schubert, 1986; Van Brussel et al., 1986) que afectan la dinámica de la colonización del microsimbiote (Batisti et al., 1992; Govers et al., 1986; Yao y Vincent, 1969). Lo cual indica que para alcanzar el máximo porcentaje de nodulación no solo es suficiente la colonización de la espermosfera-rizosfera, también es necesario que la bacteria reconozca las nuevas señales químicas que la variedad genera en la floración (Brewin, 1991; Dénarie et al., 1992; Imsande, 1981, Rossen, et al., 1985) lo que permite al microsimbionte expresar al máximo su capacidad infectiva con una mayor ocupación de los nódulos (Long, 1989) y un probable efecto positivo en el desarrollo de la planta (Singleton y Tavares, 1986).

Supervivencia de los aislados de R.etli en el suelo.

La figura 4 presenta la supervivencia (sobrevivencia) de los aislados nativos de R etli en el suelo húmedo no estéril. En ella se observa un comportamiento semejante de los aislados a las condiciones físico-químicas del suelo, con un incremento inicial en la densidad de ambas poblaciones, lo cual sugiere que durante los primeros días R. etli utilizó y agotó sus reservas. El decremento posterior de las poblaciones de los aislados probablemente fue causado, en parte, por la humedad que estimuló efectos antagónicos y /o de depredadores para Rhizobium como: Bdellovibrio, protozoarios y bacteriófagos (Lowendirf, 1980; Peña-Cabriales y Alexander, 1979). Además, el suelo careció de fuentes de carbono sencillas para estimular su crecimiento (Peña-Cabriales y Alexander, 1981), ya que por lo general estas sustancias solo se encuentran en concentraciones suficientes para la bacteria en la espermosfera-rizosfera del fríjol (Curl y Truelove, 1986; Long, 1989). Por lo que Rhizobium es dependiente de estos exudados de la espermósfera-rizosfera, únicamente supervivió en el suelo.

En el cuadro 1 presenta el análisis de varianza (ANOVA) de la dinámica de colonización de las dos aislados nativos de R.etli en las tres variedades de fríjol probadas que apoyan la interpretación de los resultados.

El cuadro 2 muestra que cuando los aislados nativos de R etli inoculados en las tres variedades de fríjol, por lo general se observó que fueron más competitivos y dominantes. Al excluir el total de nódulos formados en las plantas control fueron inducidos por otros Rhizobium spp que mostraron una densidad de población por NMP que fluctuó de 1x 102 a 1x 105 rhizobios/g de suelo, lo que sugiere que los dos aislados nativos usados en este experimento de colonización de la espermosfera-rizosfera, fueron competitivos, por ello estos resultados sirven de base para el modelo propuesto por Thies et al. (1991 a. b y 1882), en el pronostico de la posible respuesta de la leguminosa en el campo, que en este caso es motivo de otro estudio en progreso.

Cuadro 2. Por ciento de nódulos formados por dos aislados nativos de Rhizobium etli inoculados en tres variedades de fríjol.

S.N.= Sin Nitrógeno C.N.=Con nitrógeno Promedio de cuatro repeticiones

Conclusiones.

La selección de aislados o cepas nativas de R. etli es fundamental en el empleo de inoculantes para variedades especificas de fríjol, como una medida de asegurar un éxito en su repuesta en términos de rendimiento y reducción de la dosis de fertilización nitrogenada, así como la posibilidad de aplicarlas en suelos con problemas de humedad.

Dedicatoria.

A Raul y Mario Sanchez-Yañez por su apoyo y solidaridad de siempre, gracias.

Agradecimientos. A la Coordinación de la Investigación Científica de la UMSNH, Morelia, Mich, México por el proyecto 2.7 (2005-2006) por las facilidades para la publicación de este trabajo. Al M.C. Pedro Moreno por su invaluable apoyo en la estadística.

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1Coronado, R.E.,

2Peña-Cabriales J.J

2*Sánchez-Yáñez J.M3.,. .

1 FCB-UANL, Apartado Postal 414, San Nicolas de los Garza, N.L.

2 IIQB-UMSNH, Edificio B-1 58030 Morelia Michoaca, México.

*autor correspondiente

3 CINVESTAV-IPN-Unidad-Irapuato. Apartado postal 629, 36500 Irapuato Guanajuato, México.