La Portulaca olerácea. L (página 2)

ASPECTOS ANALÍTICOS

10 – Métodos para la extracción, aislamiento y caracterización de saponinas

Por lo general para la extracción de las saponinas se llevan a cabo metodologías que difieren poco entre sí. Casi siempre se parte del material vegetal seco, pulverizado y se desengrasa con benceno o éter de petróleo (este paso no es imprescindible) y se macera 48 horas con metanol, etanol o mezcla hidroalcohólica. (4, 28, 33)

Para continuar la extracción se fracciona el extracto alcohólico con n – butanol y agua, se utiliza la fracción butanólica, a partir de la cual se obtiene el crudo de saponinas. Otra vía pudiera ser concentrar el extracto alcohólico y extraer con acetato de etilo y butanol, en todos los casos se reporta que las saponinas quedan en el extracto butanólico. (7)

En esta etapa el tratamiento del extracto con butanol (que contienen la mayoría de las saponinas) con éter dietílico provoca la precipitación de la mezcla de saponinas puras. (33)

Existe otro método informado en la literatura en el cual se concentra a sequedad el extracto alcohólico y posteriormente se fracciona con etanol acuoso 50% v/v y benceno, quedando en la mezcla hidroalcohólica el crudo de saponinas. (34)

Después de extraídas las saponinas, estas se pueden separar por varias técnicas de separación analíticas y preparativas, una técnica muy usada es la cromatografía. (35,36)

Las saponinas se separan muy bien en cromatografía de papel o cromatografía de capa delgada. (14,36)

10.1-Características espectroscópicas de las sapogeninas esteroidales

Espectroscopia IR

Debido a que la cadena pirocetálica solo aparece en las sapogeninas y sobre todo el anillo F que no lo contiene ningún otro tipo de producto natural conocido, se puede determinar la presencia de sapogeninas esteroidales basado en la espectroscopia IR, basado en cuatro bandas de la región 850 – 1000 cm-1 que solo aparecen en el caso de dichos productos debido a la presencia del anillo F y que además sus relaciones de intensidades permiten reconocer si se tiene el isómero neo o iso. Las cuatro bandas en consideración apaceren en 860, 900, 920 y 985 cm-1, si la banda de 900 es más intensa que la de 920 se tiene una isosapogenina y si las intensidades de estas dos bandas se invierten se está en presencia de una neosapognenina. (34,37,38)

• Espectroscopia RMN

RMN – 1H

En los espectros RMN – 1H son característicos los corrimientos que ocurren en protones de grupos metilos en C18 ,C19, C21 y C27 El metilo del C18 aparece con un singuleto con corrimiento químico sensible a sustituyentes en los anillos C y D. De la misma forma aparace el metilo del C19 siendo este sensible a sustituyentes en los anillos A, B y C. El metilo del C21 se aprecia como un dupleto que se acopla con el H20 (J3=6,5 +0,33 Hz) y su corrimiento químico es sensible a sustituyentes en el anillo C. De igual forma el metilo del C27 se presenta como un dupleto que se acopla con el H25 (J3= 6,3 + 0.3 Hz) no siendo sensible a sustituyentes remotos por lo que aparece en delta =0.79 ppm en todos los compuestos de este tipo.

También es típico de este tipo de compuesto la señal correspondiente a los dos hidrógenos unidos al C26 Esta es una señal compleja correspondiente a dos corrimientos químicos (H 26 a y H26 b ) y prácticamente no varía en los compuestos de este tipo.

En algunos espectros se superponen a esta señal otra correspondiente a hidrógenos enlazados a carbonos que se encuentran en posición a respecto a átomos de oxígeno, pudiéndose en casos favorables ser diferenciadas. El H 26 a (axial) aparece como un tripleto alrededor de 3.32 ppm, su multiplicidad se debe a un doble acoplamiento terminal y vecinal axial – axial (J2 = J3 = 10.6 Hz), el H26 b (ecuatorial) aparece como un doblete en los 3.5 ppm, su multiplicidad se debe al acoplamiento teminal (J2 = 10.6 Hz) y vecinal ecuatorial – axial (Jea3 =2.6 Hz). El H16 a en estos compuestos aparece en 4.4 ppm como un cuarteto debido al acoplamiento con protones 15 b ecuatorial, 15 a y 17 b (cuasiecuaotrial). (39,40)

• Espectrometría de masa.

Esta técnica también se aborda ampliamente en la literatura, se han estudiado los mecanismos posibles, en la mayoría de los cuales se plantea una fragmentación primaria en el sistema espirocetálico característico de estos compuestos , de lo cual se derivan muchas posibilidades, siendo común en la mayoría de las sapogeninas una señal en m/z 115 y otra en 139 .

11- Estudio fitoquímico de saponinas.

En la realización del mismo se desarrollaron dos metodologías para la extracción y caracterización de saponinas.

Metodología Nro 1

Obtención del crudo de saponinas

Se maceraron 100 gramos de la droga seca y molinada de la planta en 400 ml de etanol al 70 % durante 48 horas, se filtró y se repitió la extracción con la misma cantidad de dicho solvente durante 24 horas. Se reunieron los extractos y se concentraron a sequedad en baño de agua.

El residuo obtenido se disolvió en 10 ml de agua destilada, se colocó en un embudo separador y se extrajo hasta el máximo agotamiento con n – butanol se concentraron los extractos a sequedad en un rotoevaporador (HB4 Basic Kika Lbortechnik) hasta la obtención de un residuo sólido.

Hidrólisis de las saponinas.

Se pesó el residuo del extracto n – butanólico y se disolvió en 20 ml de etanol, se añadió igual volumen de ácido clorhídrico 2 N y se reflujó durante 3 horas; se dejó refrescar para luego evaporar hasta la tercera parte de su volumen inicial y se vertió sobre igual volumen de agua fría. La solución acuosa obtenida se extrajo con acetato de etilo y se concentró a sequedad en un rotoevaporador (HB4 Basic Kika Lbortechnik)

El diagrama de flujo seguido para la obtención de los crudos de saponinas y su posterior hidrólisis se muestran en Anexos (Fig 1).

• Metodología Nro 2

Obtención del crudo de saponinas.

Se maceraron 100 g de la droga seca y molida en 300 ml de cloroformo durante 48 horas, se filtró, el extracto clorofórmico se concentró a sequedad en baño de agua. El material vegetal se secó en estufa(MLW WSU 100, RDA) a 35 ° C y se extrajo en Soxhlet con 500 ml de etanol hasta total agotamiento de la droga, se filtró el extracto obtenido y se concentró a sequedad en baño de agua. El residuo obtenido se disolvió en 300 ml de agua saturada con 100ml de n – butanol y se reflujaron con 300 ml de n – butanol durante 2 horas y 30 minutos. La mezcla obtenida se llevó a un embudo separador y se separaron las dos fases, el extracto butanólico se dejó reposar 24 horas para filtrar a vacío sobre sulfato de sodio anhidro (Na2SO4). Posteriormente se concentró a sequedad el extracto butanólico y se pesó. La hidrólisis se realizó exactamente como la metodología anteriormente descrita.

El diagrama de flujo seguido por esta metodología se muestra en Anexos ( Fig. 2).

Los crudos obtenidos para ambas metodologías se reunieron en una sola fracción para proceder a la separación de los productos de interés.

• Identificación de las saponinas

Para la adecuada identificaciòn se tomaron muestras provenientes de las fracciones de interés obtenidas mediante la obtención del crudo de saponinas y su posterior hidrólisis, a las cuales se le realizaron los ensayos correspondientes para identificación cualitativa de los siguientes metabolitos de interés:

• Ácidos grasos
• Tripterpenoides y esteroides
• Saponinas
• Azucares
• Sapogenina

Tabla Nro 1: Resultados de los ensayos realizados para la identificación de saponinas.

+++ Muy positivo o evidente. ++ Positivo.

+ Ligeramente positivo. – Negativo.

12- Estudios cromatogràficos realizados

• Cromatografía en capa delgada.

Cada una de las fracciones obtenidas por ambas metodologías para la extracción de saponinas, se analizaron por el método de cromatografía en capa delgada (CCD) sobre sílica gel – 60, con el fin de separar las sustancias contenidas en el crudo de saponinas e identificar las sapogeninas presentes en los extractos post hidrólisis.

Se empleó como fase móvil la mezcla n-heptano: acetato de etilo (1:1) y como revelador una solución de vainilla en ácido fosfórico al 1 % y se calentó en una estufa a 1050C durante 5 min.

Se utilizó un patrón de diosgenina para corroborar su presencia en nuestra muestra, como fue observado preliminarmente en estudios anteriores (37)

• Cromatografía Clásica en Columna.

Se separaron los productos de hidrólisis obtenidos por ambas metodologías mediante la cromatografía en columna.

Se preparó la columna por vía seca y para ello se añadió 20 g de sílica a la columna humedeciéndola con n-heptano , cuidando la homogeneidad del relleno. Una vez preparada la columna se añadió una mezcla del producto de hidrólisis, disuelto en n-heptano mezclado con sílica y se comenzó la elución con los siguientes solventes: n-heptano, n-heptano: acetato de etilo (1:1) ,n- heptano: acetato de etilo (4:6), acetato de etilo, cloroformo: metanol (1:1), cloroformo: metanol: agua (6:4:1) y cloroformo: etanol: agua (6:4:1),agua y tolueno.

Cada una de las fracciones obtenidas, se siguió por cromatografía en capa delgada sobre sílicagel – 60 empleando como fase móvil n -heptano: acetato de etilo (1:1) y como mezcla reveladora la anteriormente citada. Se comparó con el patrón de diosgenina, analizando los Factores de Retardo (Rf) de cada mancha y escogiendo aquellas fracciones que se correspondían con los resultados obtenidos para dicho patrón.

• Cromatografía de placa preparativa.

Se analizaron las fracciones de interés según los resultados obtenidos en la cromatografía en columna.

Se preparó la placa preparativa utilizando sílica gel sobre soporte de vidrio de 20cm X 20cm.

Las manchas se arrastraron disolviéndolas con una mezcla de n-heptano: acetato de etilo (1:1), filtrando posteriormente con papel de filtro para desechar los restos de sílica gel.

El filtrado se dejó reposar por varios días, observándose la precipitación de diminutos cristales.

12.1 Resultados obtenidos en estudios cromatográficos.

• Cromatografía en capa delgada.

Se analizaron las diferentes fracciones obtenidas en cada una de las metodologías desarrolladas. Los cromatogramas obtenidos se muestran a continuación(Fig. 1)

A – Metodología Nro 1 B – Metodología Nro 2

m1-Residuo del extracto n-butanólico (crudo de saponinas)

m2-Residuo del extracto hidrolizado(sapogeninas)

Fig. 1-Cromatogramas obtenidos para el crudo de saponinas y el hidrolizado en ambas metodologías.

Como se puede apreciar no hubo una buena separación de los productos obtenidos en el crudo de saponinas, para ambas metodologías.

En el caso de las fracciones post -hidrólisis, podemos apreciar con mayor nitidez la aparición de manchas bastante definidas, de coloración verde.

• Cromatografía en Columna.

Mediante esta técnica cromatográfica se reunieron los hidrolizados obtenidos por ambas metodologías con un peso final de 15.79g, para separar adecuadamente los productos. Cada una de las fracciones eluidas se analizaron por cromatografía en capa delgada, especialmente las fracciones de acetato de etilo: n-heptano (1:1) que fueron escogidas para continuar la separación debido a la aparición de los productos de interés.(Fig. 2)

F1– Fracción eluida Nro 1

F2– Fracción eluida Nro 2

F3– Fracción eluida Nro 3

Fig. 2– Cromatogramas obtenidos para las fracciones de interés, eluidas en la Cromatografía en Columna.

Al analizar el recorrido de las manchas se puede apreciar que hubo una buena separación de los productos, obteniéndose tres manchas bien definidas y nítidas en cada caso, de coloración que varía del verde al amarillo verdoso.

Además se compararon de forma preliminar los Rf para cada una de las manchas con un patrón de diosgenina de valor de Rf = 0.51 , observándose similitud entre este y el valor de Rf calculado para la mancha intermedia de las tres fracciones escogidas(Fig. 3). Estas fracciones fueron reunidas en una fracción total de 0.79g con el 5% de la muestra inicial introducida en la columna.

Ft –Fracción total P –Patrón de diosgenina

Fig. 3 –Cromatogramas del patrón de diosgenina comparado con el de una fracción total eluída en la mezcla acetato de etilo: n –heptano (1: 1)

Las restantes manchas no pudieron ser analizadas por no contar con disponibilidad de otros patrones

• Cromatografía de placa preparativa

Con el objetivo de arrastrar la mancha de interés eluida por la columna, para su posterior análisis espectroscópico, desarrollamos la técnica de cromatografía preparativa.

Los resultados de la misma se muestran en la Fig. 4. Como se puede apreciar obtuvimos franja de color amarillo -verdoso luego de ser adecuadamente marcada, se arrastró y tres franjas de colores : verde oscuro, amarillo – verdoso y verde claro respectivamente. La disolvió en la mezcla de acetato de etilo: n-heptano (1:1).

Fig. 4–Cromatograma de la fracción de interés eluida por la columna obtenida mediante una técnica preparativa

Luego de ser decantado y filtrado con papel de filtro, para eliminar los restos de silica, se dejó reposar durante tres días, al cabo de los cuales observamos la aparición de un precipitado blanco amarillento, con un peso de 0.21g .Esto se corresponde con el 1.33% del hidrolizado total introducido en la columna .

Este producto se comparó con el patrón de diosgenina mediante cromatografía de placa delgada , bajo las mismas condiciones cromatográficas empleadas anteriormente .Como muestra la Fig 8 , el producto aislado presenta un Rf muy similar al patrón .

Este producto aislado de la fracción post- hidrólisis en acetato de etilo : n– heptano (1:1) se corresponde con el 0.1% de la muestra inicial de 200g de planta seca y molinada que se empleó en el estudio .

m– Producto aislado p– Patrón de diosgenina

Fig. 5– Cromatogramas del producto aislado y el patrón de diosgenina.

Se realizó la detección del punto de fusión a la muestra en una microplatina digital (elctrothermal 9200) y el rango de valor detectado fue entre 206 y 209ºC.

13. Estudios espectroscópicos

Una muestra de los cristales separados se analizó mediante Espectroscopía UV disolviéndolos en acetonitrilo y empleando un equipo(Spectronic Genesys’’2) Además se tomó otra muestra proveniente del mismo precipitado y se analizó mediante Espectroscopía IR, empleando un equipo (FTIR Vector 22 de la firma Broker), en pastilla de bromuro de potasio (KBr).

13.1-Resultados obtenidos en estudios espectrocópicos

• Espectroscopia UV

El espectro obtenido se muestra en Anexos (Fig. 9)

Atendiendo al espectro UV se puede sugerir la presencia de transiciones ns * que corresponde con los grupos hidroxilos alcohólicos, lo cual se puede corroborar con los resultados del espectro IR .Adicionalmente se realizó el ensayo de identificación con sodio , este resultó positivo, indicando la posible existencia en el compuesto de los grupos mencionados.

• Espectroscopia IR

El espectro obtenido se muestra en Anexos (Fig. 10)

Al realizar el análisis del mismo pudimos observar lo siguiente:

• 3449.82 cm-1, banda puntiaguda y ancha indicativa de OH asociado y de una posible superposición, lo que sugiere que el OH pueda ser primario, secundario o terciario presentes en flavonoides, alcaloides y triterpenos. Estas bandas aparecen entre 3800cm-1 y 3500cm-1, según la literatura.
• 2951.09 cm-1, banda alargada y estrecha indicativa de la presencia de enlaces C SP3 –H. Estas bandas aparecen entre 3000cm-1 y 2800cm-1, según la literatura.
• 1637.35 cm-1 , banda pequeña de hombro ancho indicativa de la presencia de enlaces C- N. Lo cual sugiere que el compuesto se encuentra en forma de sal . Estas bandas aparecen en 1640cm-1, según la literatura.
• 1456.69cm-1, banda pequeña y estrecha indicativa de la presencia de enlaces C=C. Estas bandas aparecen en 1460cm-1, según la literatura.
• 1376.67 cm-1 , banda estrecha y puntiaguda indicativa de la presencia de enlaces C sp2 – H. Estas bandas aparecen en 1380cm-1, según la literatura.
• 1052.51 cm-1 , banda alargada y estrecha indicativa de la presencia de enlaces C – O simple . Estas bandas aparecen en 1050cm-1, según la literatura.
• 1241.52 cm-1 – 642.29 cm-1, bandas características de la presencia del anillo bencénico. Estas bandas aparecen entre 1000 cm-1 y 600 cm-1, según la literatura.
• 981.78cm-1, 920.14cm-1, 899.43cm-1, 865.17cm-1, cuatro bandas características de sapogeninas esteroidales debido a la presencia del anillo F. Estas bandas aparecen a 985cm-1,920cm-1, 900cm-1 y 860cm-1 respectivamente, según la literatura. Además como la banda de 900cm-1 es más intensa que la de 920cm-1 estamos en presencia de una isosapogenina .

Luego de analizar nuestro producto aislado tanto por métodos cromatográficos como espectroscópicos , le asignamos la estructura química de la diosgenina (Fig. 5) ,

sapogenina esteroidal de interés farmacéutico notable , según se describe en la literatura (39).

Fig. 5 Estructura química de la diosgenina en la conformación iso .

Usos En medicina popular se emplea en el tratamiento del estreñimiento, cistitis, uretritis, urolitiasis, edemas, resfriados, bronquitis, gastroenteritis, diabetes, parasitosis intestinales. En uso tópico: gingivitis, estomatitis, forúnculos, abscesos, reumatismo, heridas, grietas en los labios,conjuntivitis. ContraindicacionesLitiasis oxálicas.(6,11)

Formas galenicas. Posologia.

• Uso alimentario (planta fresca) En ensalada

• Infusión: Una cucharada de postre por taza, 2- 3 veces al dia después de las comidas.(6,11,39)

Presentación

Planta suelta.

Toxicidad

No se reporta toxicidad (6,11)

Efectos biológicos atribuidos

Todas las saponinas son capaces de reducir la tensión superficial y alterar la permeabilidad de las membranas celulares.Su actividad antibacteriana se debe a la formación de complejos con el colesterol presente en la membrana celular. (39,40)

En el caso de las triterpenoidales, tanto las saponinas crudas como las purificadas tienen acción estimulante sobre el sistema nervioso central, antipirética, sedante, expectorante, antitusiva, previenen las úlceras provocadas por el estrés, aceleran la movilidad intestinal y muestran actividad antiinflamatoria. Promueven la síntesis de ARN y de proteínas. (26,31)

También pueden ser usadas en la prevención y terapia de la toxicidad clínica ya que pueden modular la morfina y cocaina, inductores de la disfunción dopaminérgica. (17)

En 1996 fue estudiado el papel de las saponinas en la prevención del daño producido por el Peróxido de Hidrógeno en fibroblastos del ratón, así como los efectos inhibitorios de algunas saponinas esteroidales sobre los espermatozoides humanos in vitro. (32, 33).

Se ha observado que la presencia de las saponinas acelera el crecimiento de los embriones vegetales, lo que paralelamente a su amplia distribución en el reino vegetal hace pensar en un posible papel hormonal. (4)

Son poco absorbidas en los animales superiores, por lo que actúan principalmente como irritantes de las mucosas. Inyectadas directamente producen hemólisis, diuresis y acciones directas sobre todo el sistema nervioso central que pueden ser letales. También provocan degeneración de las células hepáticas con la consecuente fribrosis cuando se administran dosis altas. (4)

En 1997 se observó el papel que desempeñaron las saponinas presentes en las fibras dietéticas no digeribles en el secuestro de ácidos grasos biliares y esteroles necesarios, uno de cuyos efectos principales es la disminución de la concentración de colesterol sérico (34) y la mayor limitante en el empleo de estos compuestos es la toxicidad asociada con su potencial hemolítico, para ello es importante conocer la posibilidad y magnitud del cambio en la actividad hemolítica de los crudos de saponinas.

Varios estudios recientes tanto in vitro como in vivo, han reportado las propiedades anticancerígenas de las saponinas, también se ha propuesto que tengan efectos

hipocolesterolémicos e inmunoestimulantes. El mecanismo propuesto en la actividad anticancerígena es el efecto antioxidante directo y citotoxicidad selectiva de células, inmunomodulación, metabolismo ácido y neutro del esterol y regulación de la proliferación celular. Entre las propiedades químicas de las saponinas su polaridad, hidrofobicidad y naturaleza de los grupos reactivos constituyen determinantes importantes de sus propiedades biológicas. (35)

Por lo antes expuesto, se han hecho numerosos estudios para la detección, aislamiento, obtención y análisis de este tipo de metabolitos. (2, 31, 34, 36, 37, 38, 39,40)

Conservaciòn

La planta seca y molinada se conserva en bolsas plàsticas a temperatura ambiente por el perìodo de un año(6)

CONCLUSIONES

1. Se encontraron datos de gran interés sobre la Portula oleracea L que pueden utilizarse en estudios posteriores.
2. Se realizó la monografía de la Portula oleracea L, la cual no aparece en ninguna farmacopea internacional, estos resultados resultan novedosos para la especie vegetal estudiada.

BIBLIOGRAFÍA

1. Simopoulus, A.P. ; Norman, H.A. ; Gillaspry, J.E. Pruslane in human nutrition a nd its potential for world agriculture. World Rex Nutr Diet. Basel, Karger. 1995; 77: 47-74.
2. Batista Báez, Mayda; Dominicés Bravo, María Elena; Sarduy Domínguez, Rosa; Fernández de Córdoba, Hilda. Tamizaje de alcalçoides y saponinas de plantas que crecen en Cuba. Moa I. Revista Cubana de Farmacia. 1994; 28 (1): 61-68.
3. Raigorosky Cardoso, Gloria. Importancia de la elaboración y utilización de los medicamentos de origen natural en Cuba. Revista Cubana de farmacia. 1995; 29(1): 68-70.
4. García Fuentes, Lázaro. Continuación del Estudio Fitoquiímico de la Portulaca olerácea L. con fines farmacéuticos. Tesis para optar por el grado de Licenciado en Ciencias Farmacéuticas. 2000.
5. Iyarreta Veitía, Maité. Estudio preliminary de la Portulaca oleracea L. como droga antihelmítica. Tesis `para optar por el Título de maestro en Ciencias en la especialidad de Química Farmacéutica. 1996.
6. Rodríguez Díaz, Maité; Rodríguez Escobar, Maidany. Continuación del estudio farmacognóstico y fitoquímico de la Portulaca oleracea L. como droga hipolipemiante. Trabajo de Diploma. 1997.
7. Rodríguez Martínez, Maileny; Truffín Mas, Yoalis. Continuación del estudio farmacognóstico y fitoquímico de la Portulaca oleracea L con fines farmacéuticos. Tesis para optar por el grado de Licenciado en Ciencias Farmacéuticas. 1999
8. Martínez, D.Y. Estudio farmacológico y toxicológico de la Boldoa purpurascens. Trabajo de Diploma. 1998.
9. Milian Díaz, Lázara. Estudio fitoquímico y genotóxico del extracto acuoso de Boldoa purpurascens. Trabajo de Diploma. 2000.
10. Hermano, León y Hermano Alain. Flora de Cuba. Tomo II. Habana 1951: 146.
11. Roig, Juan Tomás. Plantas Medicinales, aromáticas o venenosas de Cuba. Editorial Científico Técnica. La Habana. 1988: 910-911.
12. Guil, J.L; Torija, E; Jiménez J.J: Composición centesimal de plantas silvestres. Alimentaria. 1997: 59-64.
13. Habtemeriam, S.; Harrely, A.L.Waterman,P.G. The muscle relaxant properties of Portulaca oleracea are associated with high concentrations of potassium ions. J- Ethnopharmacol. 1993; 40 (3): 195:200
14. Jaffer , H.J.; Hawad, A.M.; Naji,A.; Ala Al, Naib; Omar, S.A. Phitochemical and biological screenin of some iraquí plants. Fitoterapia. 1988; LIX(3): 229 – 233.
15. Simopoulus, A.P. ;Salem, M. A terrestial source of omega 3 fatty acid. New Engl. J. Med. 1986; LIX (315): 833.
16. Chan, K; Islam, M.W; Kamil, M.; Radhakrishnan, R.; Zakaria, M.N.M.; Habibulllah, M. The analgesic and antiinflamatory effects of Portulaca oleracea L. Journal of Ethnopharmacology. 2000; 73: 445-451.
17. Koch, H.P. Purslane: Omega 3 fatty acids in an old medicinal plant. Deutsche Aporker Zeitung. 1998 Nov. 24; 128: 2493-2495.
18. Zhou, J.; Tian, G.J.; Fu, J.W. Studies on the preparation of machixian oral liquid. Chinese Traditional and herbal Drugs. 1995: 239-241.
19. Okwasaba, F.; Ejike,C.; Parry,O. Comparison of the skeletal muscle relaxant properties of portulaca oleracea extract with dantronele sodium and methoxyverapamil. Journal of Ethnopharmacology. 1987: 85-106.
20. Okwasaba, F.; Ejike,C.; Parry,O. Skeletal muscle relaxant properties of the aqueous extract of Portulaca oleracea. Journal of Ethnopharmacology. 1986: 139-160.
21. Parry, O; Marks, J.A. Okwasaba, F.K. Skeletal muscle relaxant action of Portulaca Oleracea: role of potassium ions. Journal of Ethnopharmacology. 1993; 40(3): 187-194.
22. Parry, O; Okwasaba, F.K.; Ejike, C. Skeletal muscle realxant action of an aqueus extract of Portulaca Oleracea in the rat. Journal of Ethnopharmacology. 1987: 247-253.
23. Parry, O; Okwasaba, F.K.; Ejike, C. Effect of an aqueus extract of Portulaca olareacea leaves on smooth muscle and rat blod pressure. Journal of Ethnopharmacology. 1988: 33-34.
24. Marcano, Deanna; Haseqawa, Malasia. Triterpenos. Fitoquímica Orgánica. p 233-274.
25. Cuellar Cuellar, Armando.Farmacognosia y productos naturales. Editorial Félix Varela, Ciudad de La Habana. 2001.
26. Sánchez Sardinas, Misdalis. Determinación cuantitativa de saponinas en el jugo de henequén (Agave focroydes LEM) por actividad hemolítica .Trabajo de diploma .1994
27. Lock de Ugaz, Olga. Investigación fitoquímica. Fondo Editorial. Pontifia Universidad Católica de Perú. 1988: 64-83, 183-187.
28. Claus, Edward P.; Tyler, Bravo E. Glicósidos. En Farmacognosia. Edición Revolucionaria. 1998: 110-118.
29. Alvarez, Alicia, Quintero, Mirna, Larionova, María, Manzini, María Eugenia, García, Hilda, Cuevas, Mariana. Evaluación de la actividad antiulcerosa de un extracto total y de tres extractos obtenidos por fraccionamiento fitoquímico de Bidens pilosa . Lin. Revista Cubana de Farmacia 1990; 24 (2): 297-303.
30. Jian Wang, Jun; Fei Eang, Yi; Cong Li, Ying; Ying Yang, Hong; Ren Yang, Chong. Inhibitory effects of some steroidal saponins of human spermatozoa in vitro. Planta Médica. 1996; 62(2): 130-132.
31. Yoshikoshi, Masaki; Yoshiki, Yumiko; Okubo, Kazuyoski; Seto, jiro; Sasaki; Yasuyuki. Prevention of hydrogen peroxide damage by soybean saponins to mouse fibroblast. Planta Médica. 1996; 62(3): 252-256.
32. Hernández Royero, Ricardo. Obtención de crudos de saponinas hipocolesteromizantes del Chenopodium quinoa Willd. Revista Cubana de Medicina Militar. 1997; 26(1): 55-62.
33. Rao, A.V. Anticarcinogenic Properties of plant Saponins Second International Symposium on the role of soy in preventing and treating chronic disease. Departament of Nutritional Sciences University of Toronto. 1996.
34. do Rosarios Daros, María; de Abreus Matos, Francisco José; Paz Pazende, José. A: new triterponoid saponin, Bredemeyeroside B, from the rotos of Bredemeyea floribunda. Planta médica. 1996; 62 (6): 523-527.
35. Dominicis María Elena; Oquendo, Marledys; Batista, Mayda; Herrera, Pedro. Tamizaje de alcaloides y saponinas de plantas que crecen en Cuba II. Península de Guanahacabibes. Revista Cubana de Farmacia. 1995; 29 (1):52-57.
36. Fernández De Córdova, Hilda; Batista Báez, Mayda; Sarduy Domínguez, Rosa. Tamizaje de alcaloides y saponinas de plantas que crecen en Cuba III. Sierra del Rosario Revista Cubana de Farmacia. 1995; 29 (1): 58-65.
37. Gamal E.I, Din Husein Maran; Werher Glombitzsa, Karl; Wisa Mithom, Youseff; Hartmann, Rudof; George Michel, Camilia. Novel saponins from Zizuphus spinacristi Growing in Egipdt. Planta Médica. 1996; 62 (2): 163-166
38. Sandoval López, Daisy; Oquendo Suárez, Marledys. Estudio fitoquímico preliminar de detección de alcaloides y saponinas en plantas que crecen en Cuba. Revista Cubana de Farmacia. 1990; 24 (2): 288-296.
39. Santos Morell, Tania ; Torres Chaviano, Ivonne. Extracciòn, aislamiento y caracterizaciòn de una sapogenina esteroidal a partir de un extracto hidroalcohòlico de Portulaca oleraceaL.Tesis 2002.
40. Rodríguez Gutiérrez , Elianet . Avances en el estudio fitoquimico de dos especies vegetales :Boldoa purpurascens y Portulaca oleracea L. Trabajo de diploma . 2001

ANEXO

Fig. 1-Metodología Nro1

Fig. 2-Metodología Nro2

Ensayo de Sudán III (ácidos grasos):

Permite reconocer en un extracto la presencia de compuestos grasos, para lo cual a la alícuota de la fracción en el solvente de extracción se le añade 1ml de una solución diluída en agua del colorante Sudán III o Sudán IV. Se calineta en baño de agua hasta evaporación del solvente.

La presencia de compuestos grasos se considera positiva si aparecen gotas o una película coloreda de rojo en el seno del liquído o en las paredes del tubo de ensayo, respectivamente.

Ensayo de Liebermann- Burchard (triterpenos y/o esteroides):

Permite reconocer en un extracto la presencia de triterpenos y/o esteroides, por ambos tipos de productos poseer un núcleo de androstano, generalmente insaturado en el anillo B y la posición 5-6. Para ello si la alícuota del extracto no se encuentra en cloroformo, debe evaporarse el solvente en baño de agua y el residuo redisolverse en 1ml de cloroformo. Se adiciona 1ml de anhidrido acético y se mezcla bien. Por la pared del tubo se dejan correr 2-3 gotas de ácido sulfúrico concentrado sin agitar. Un ensayo positivo se tiene por un cambio de coloración:

1. Rosado- azul muy rápido.
2. Verde intenso, visible aunque rápido.
3. Verde oscuro- negro, final de la reacción.

A veces ensayo queda en dos fases o desarrollo de color. Muy pocas veces puede observarse el primer cambio. El tercer cambio generalmente ocurre cuando el material evaluado tiene cantidades importantes de estos compuestos. Esta reacción también se emplea para diferenciar las estructuras esteroidales de las triterpénicas, las primeras producen coloraciones azul a azul verdoso, mientras que para las segundas se observa rojo, rosado o púrpura. Estas coloraciones pueden variar por interferencias producidas por carotenos, xantofilas y esteroides saturados que puedan estar presentes.

Observación: Para realizar este ensayo no puede haber agua en el medio de reacción, pues esta con el ácido sulfúrico puede reaccionar de forma violenta.

Ensayo de Espuma (saponinas):

Permite reconocer la presencia de saponinas, tanto del tipo esteroidal como triterpénicas. De modo que si la alícuota se encuentra en etanol, se diluye en 5 veces su volumen en agua y se agita la mezcla fuertemente durante 5-10min. El ensayo se considera positivo si aparece espuma en la superficie del líquido de más de 2mm de espesor o altura y persiste por más de 2 min.

Ensayo de Rosemheim ( triterpenos y esteroides):

1ml de la fracción en cloroformo se mezcla con 1ml de ácido tricloacético al 90% en un tubo de ensayos. Si hay dienos aparece una coloración azul o violeta en el tiempo.

Ensayo de Salkowski ( triterpenos y esteroides):

1ml de la fracción en cloroformo se coloca en un tubo de ensayos con 1ml de ácido sulfúrico concentrado. Un ensayo positivo se muestra con una coloración amarillo rojiza.

Molish(azucares):

A 1 ml del extracto se le adiciona 0.5ml de una solución de a – naftol al 5% en etanol . Se mezcla y por la pared del tubo de ensayo se deja caer 2 o3 gotas de ácido sulfúrico concentrado . La aparición de un anillo violáceo en la interfase indica una reacción positiva.

Antrona (saponinas):

1 ml del extracto en agua se mezcla con 0.5 ml de antrona al 0.01% en ácido sulfúrico concentrado recién preparada .La aparición de un anillo azul en la interfase indica una reacción positiva.

Vainillina(sapogeninas ):

A 1 ml del extracto se le adiona 0.5 ml de una solución de vainillina al 1% en etanol y se acidifica con ácido clorhídrico o sulfúrico concentrad. La aparición de colores variables indica una reacción positiva.

Ensayo de Woller (saponinas triterpénicas):

1ml del extracto se trata con unas gotas de cloruro de tionilo que contiene 0.1% de cloruro estáñico , férrico o antimónico anhidros . Se tapa el tubo de ensayo y si en una hora hay cambio de coloración, indica un ensayo positivo.

Fig. 3– Tamizaje fotoquímico realizado a ambos extractos

Autor:

Lic. Tania L. Santos Morell.

Año 2004