Resistencia de phytophthora infestans (montagne) de bary a metalaxil, en cultivo de papas en el Norte de Chile (página 2)

MATERIALES Y MÉTODOS

Colección de aislamientos de P. infestans

Los aislamientos de P. infestans fueron colectados en cultivos de papa cv. Cardinal afectados por tizón tardío, en siete localidades de la IV Región y tres localidades de la V Región. En la mayoría de los casos estos cultivos habían sido establecidos en áreas donde se realiza monocultivo de papas (Cuadro 1). En cada localidad el muestreo se realizó en cultivos que estaban en plena fase de tuberización, manejados con diferentes programas de aplicaciones fungicidas, y todos ellos habían recibido por lo menos una aplicación de metalaxil para el control de la enfermedad.

Cuadro 1. Localidades de muestreo en cultivos de papa y número de aislamientos de Phytophthora infestans colectados en cada una de ellas durante las temporadas 1999 y 2000 para los estudios de sensibilidad in vitro a metalaxil. Table 1. Sampling locations for potato crops and number of Phytophthora infestans isolates collected at each site during 1999 and 2000 seasons to study the in vitro sensitivity to metalaxyl.

La colecta de los aislamientos desde material infectado, se realizó durante las temporadas 1999 y 2000, entre los meses de mayo y agosto, a partir de esporangios individuales obtenidos desde la zona de avance del patógeno en hojas y folíolos de plantas enfermas, previamente mantenidos en cámara húmeda a temperatura ambiente por 24 h, para inducir la formación de esporangios. Los esporangios fueron traspasados a medio de cultivo Agar V8 enriquecido con rifampicina (20 mg L-1), sulfato de polymixina B (50 mg L-1), ampicilina (200 mg L-1) y los fungicidas pentacloronitrobenceno (67 mg L-1) y benomilo (100 mg L-1), para posteriormente ser incubados 3 a 4 días en oscuridad a 18°C. Los aislamientos fueron almacenados en tubos de ensayo que contenían 15 mL de agar centeno tipo B (Deahl y Demuth,1993).

Generalmente se ha utilizado una concentración de 10 mg L-1 de metalaxil para calificar resistencia o sensibilidad de biotipos de P. infestans (Shattock, 1988; Deahl y Demuth, 1993). En este estudio, esta concentración fue usada tanto en pruebas in vivo como in vitro, solo para separar en forma preliminar grupos de aislamientos de P. infestans y clasificarlos como sensibles o resistentes al fungicida.

Evaluación in vitro.

El comportamiento in vitro de los aislamientos fue evaluado en una primera etapa de acuerdo a la metodología empleada por Shattock (1988) y Deahl y Demuth (1993). Para esto, cilindros de agar centeno B con micelio obtenido desde el borde de colonias de cada aislamiento de P. infestans, previamente mantenidas en estufa de incubación en oscuridad a 18°C por 6 días, fueron establecidos simultáneamente sobre agar centeno B enriquecido con 10 mg L-1 de metalaxil y sobre placas de agar centeno B sin el fungicida (testigo). Como control se utilizó un aislamiento de P. infestans colectado en Toltén ( IX Región), previamente calificado como sensible a metalaxil.

El crecimiento in vitro de cada aislamiento fue medido después de un período de incubación de 6 días a 18°C utilizando la siguiente ecuación:

donde PC = porcentaje de crecimiento; DMCM = díámetro medio colonia creciendo en agar centeno B y 10 mg L-1de metalaxil ; 5 mm = díámetro del cilindro con micelio; y DMCA = diámetro medio colonia creciendo en agar centeno B

El criterio empleado por Shattock et al. (1990) y Deahl y Demuth (1993) califica como resistentes a metalaxil a los aislamientos con porcentaje de crecimiento igual o mayor a 60%, intermedios de 10 a 60%, y como sensibles a aquellos con un porcentaje de crecimiento radial menor a 10%.

En una segunda etapa, para cada aislamiento se estimó la concentración media efectiva (CE 50), variable definida como la concentración media de metalaxyl necesaria para inhibir el 50% del crecimiento de micelio in vitro de cada aislamiento. La CE 50 fue estimada mediante un modelo de regresión lineal entre el logaritmo de seis concentraciones de metalaxil y su porcentaje de inhibición. Para estimar este valor, inicialmente se utilizó un rango de concentraciones que varió entre 0,01 y 100 mg L-1 de metalaxil (Sozzi y Staub, 1987; Manriquez, 1995), sin embargo, ninguno de los aislamientos del patógeno fue inhibido por 100 mg L-1 de metalaxil, determinando la necesidad de utilizar concentraciones de 0, 150, 250, 350, 450 y 550 mg L-1 de metalaxil (Deahl y Demuth, 1993). Por cada aislamiento y concentración de metalaxil se usaron cuatro repeticiones. El porcentaje de inhibición fue transformado a unidades Probits, mediante la tabla propuesta por Finney (1964).

Evaluación in vivo

Para comparar la sensibilidad a metalaxil in vitro e in vivo, durante la temporada 1999 se realizó un bioensayo inoculando un grupo de ocho aislamientos de P. infestans, identificados como A-33, A-35, A-42, A-45, A-48, A-53, A-126 y A-189, sobre folíolos de papa de la variedad Cardinale. Para esto, folíolos axilares de 14 mm de diámetro, obtenidos desde plantas de 30 días de edad que no habían sido tratadas con fungicida, fueron sumergidos y agitados en una solución de 10 mg L-1 de metalaxil durante 5 min, para luego ser mantenidos por 24 h en condiciones de cámara húmeda. El inóculo fue obtenido a partir del lavado con agua destilada estéril de la superficie de colonias individuales de 14 días de edad de los aislamientos del patógeno, desarrolladas en agar centeno B. Para inducir la formación de zoosporas, los esporangios obtenidos por lavado fueron incubados 4°C por 90 min. Cada suspensión fue ajustada con agua destilada estéril a 4 x 104 zoosporas por mL (Goodwin y McGrath 1995). Cumplida esta etapa, 15 folíolos fueron inoculados con 20 m L folíolo-1, de la suspensión de zoosporas de cada aislamiento, y luego mantenidos a 18°C con fotoperiodo 12:12 (luz:oscuridad) (entre 6000 a 7500 lux), por 7 días. Como testigo se utilizaron folíolos sumergidos y agitados en agua destilada estéril por igual período de tiempo. Como control se utilizó el aislamiento sensible colectado en la IX Región.

Para evaluar la severidad se utilizó una escala de 0 a 5, que representó a 0; de 0,1 a 20; de 20 a 40; de 40 a 60; de 60 a 80; y de 80 a 100% de la superficie del folíolo cubierta por esporangios (Deahl y Demuth, 1993 ; Goodwin y McGrath, 1995).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos en pruebas preliminares in vitro, donde se hicieron crecer los aislamientos colectados durante la temporada 1999 en localidades de la IV y V Región, sobre agar centeno B con 10 mg L-1 de metalaxil, demostraron que la totalidad de ellos desarrollaron colonias con porcentajes de crecimiento que oscilaron entre 80 y 100% del crecimiento observado en sus colonias testigos. En este ensayo, el aislamiento control caracterizado como sensible, fue el único totalmente inhibido por 10 mg L-1 de metalaxil (Figura 1).

Figura 1. Distribución de frecuencias en función del porcentaje de crecimiento relativo (respecto colonia testigo) de 164 aislamientos de Phytophthora infestans sobre agar centeno B y 10 mg L-1 de metalaxil de Regiones IV y V. Temporada 1999. Figure 1. Frequency distribution as a function of relative growth percentage (over control) of 164 Phytophthora infestans isolates, on agar rye B and 10 mg L-1metalaxyl Regions IV and V. Season 1999.

Los resultados del bioensayo realizado durante 1999 utilizando el control sensible y la muestra de ocho aislamientos de P. infestans, revelaron que al ser inoculados artificialmente, todos ellos fueron capaces de colonizar sobre el 80 % de la superficie de folíolos de papa variedad Cardinal, que previamente habían sido sumergidos en 10 mg L-1de metalaxil. En función del porcentaje de tejido colonizado fueron calificados con nota de ataque 5. Un comportamiento diferente fue observado en el control sensible y en el aislamiento A-33 los cuales presentaron notas 0 y 4, respectivamente (Cuadro 2).

Cuadro 2. Porcentaje de colonización en folíolos de papa variedad Cardinal, sumergidos en 10 mg L-1 metalaxil antes de ser inoculados artificialmente con zoosporas y esporangios de ocho aislamientos de Phytophthora infestans colectados durante la temporada 1999 en las regiones IV y V, Chile. Table 2. Colonization percentage on Cardinal variety potato leaflets dipped into 10 mg L-1metalaxyl before artificial inoculation with zoospores and sporangias from eight Phytophthora infestans isolates, collected during 1999 and 2000 seasons in the IV and V Regions, Chile.

1 : 0: 0; 1: 0,1-20; 2: 20-40; 3: 40-60; 4: 60-80; 5: 80-100 % de la superficie del folíolo cubierta por esporangios.

Bajo las condiciones de este estudio, los resultados demostraron que mientras el aislamiento control presentó una CE 50 de 0.1 mg L-1 de metalaxil, la sensibilidad de los aislamientos colectados en localidades de la IV Región durante 1999 expresada a través de sus CE 50, osciló entre 243 y 687 mg L-1 de metalaxil. La sensibilidad promedio de las localidades presentó una variación entre 377,5 y 519,5 mg L-1 de metalaxil (El Romero y Altovalsol, respectivamente). Durante la temporada 2000, 58 aislamientos de P. infestans colectados sobre cultivos de Cardinal, en las mismas localidades de esta región, presentaron una CE 50 entre 260 y 560 mg L-1 de metalaxil.

Para aislamientos colectados en la V Región durante 1999 se estimaron valores de CE 50 que oscilaron entre 233 y 633 mg L-1 de metalaxil. En la temporada siguiente, es decir en el ciclo de crecimiento 2000, los valores de CE 50 oscilaron entre 250 y 587 mg L-1 de metalaxil. En ambas temporadas los aislamientos de P. infestans colectados en La Ligua, localidad que históricamente ha concentrado la superficie más importante cultivada con papa en la V Región, presentó la CE 50 promedio más alta (Cuadro 3).

Cuadro 3. Número, concentración efectiva media (CE 50), máximo, mínimo y promedio de aislamientos de Phytophthora infestans, colectados durante las temporadas 1999-2000, en cultivos de papa establecidos en siete localidades de la IV Región y en tres localidades de la V Región, Chile. Table 3. Number, effective concentration (CE 50), maximum, minimum and average of Phytophthora infestans isolates, collected during 1999 and 2000 seasons from potato crops established at seven sites in the IV Region and three sites in the V Region, Chile.

Los resultados demostraron que la totalidad de los aislamientos colectados durante las temporadas 1999 y 2000 fueron resistentes a este fungicida. En ambas temporadas, se obtuvo un rango de variación bastante amplio en la CE 50 estimada para aislamientos dentro de cada localidad, sin embargo, no se consideró relevante agrupar o diferenciar estadísticamente individuos resistentes, toda vez que sus CE 50 fueron por lo menos 200 veces superiores a la CE 50 estimada para el control sensible (Cuadro 4), o para los valores determinados por Power et al. (1995) para aislamientos sensibles, los cuales oscilaron entre 0,00002 y 1 mg L-1 de metalaxil.

Cuadro 4. Agrupación en rangos arbitrarios de valores de concentración efectiva media (CE50) (mg L-1 metalaxil) obtenidos en aislamientos de Phytophthora infestans, colectados durante las temporadas 1999 y 2000, desde cultivo de papa de siete localidades de la IV Región y en tres localidades de la V Región, Chile. Table 4. Arbitrary range groupings of CE50 (effective concentration) (mg L-1 metalaxil) values obtained from Phytophthora infestans isolates collected during the 1999 and 2000 seasons from potato crops at seven sites in Region IV and three sites in Region V, Chile.

En ninguna de las localidades estudiadas se obtuvo información relacionada con las pautas de control químico históricamente empleadas en el manejo de la enfermedad. Esta situación no permite analizar alguna tendencia o patrón de sensibilidad en función de la localidad o manejo del patógeno. Sin embargo, una agrupación de los aislamientos de P. infestans, en rangos arbitrarios de CE 50, permitió verificar que en los aislamientos colectados en 1999, solamente el 9,6 y 10,1% de la colección estudiada de la IV y V Región respectivamente, presentó una CE 50 no superior a 300 mg L-1 de metalaxil, al mismo tiempo que 74 y 75,2% de los aislamientos de estas dos regiones presentaron CE 50 superior a 350 mg L-1 de metalaxil. Similar agrupación realizada para aislamientos de P. infestans colectados durante la temporada 2000 en las mismas localidades de la IV y V Región determinó que 6,8 y 9,3% de los aislamientos, respectivamente, alcanzaron CE 50 no superior a 300 mg L-1 de metalaxil, al mismo tiempo que para 89,6 y 78,1% de ellos, respectivamente, se determinó una CE 50 superior a 350 mg L-1 de metalaxil.

El crecimiento experimentado por el control sensible sobre medio de cultivo y su esporulación sobre folíolos del cv. Cardinale que no habían sido expuestos a metalaxil, descarta la posibilidad de atribuir los resultados obtenidos a los procedimientos metodológicos o materiales de cultivo empleados en el estudio. La recolección de aislamientos en estados de crecimiento anteriores a la fase de tuberización, probablemente habrían permitido detectar aislamientos sensibles dentro de las colecciones estudiadas. Sin embargo, frecuencias similares de aislamientos resistentes han sido documentadas en estudios donde se asoció el carácter de resistencia a metalaxil con fallas en el control de P. infestans (Davidse et al., 1983, 1989; Dowley y O`Sullivan 1985; Papas,1985; Shattock et al., 1990).

En algunos casos, la sola demostración de resistencia in vitro puede tener un significado muy limitado, toda vez que la resistencia en tejidos de la planta, como por ejemplo discos de tubérculos, no ha mostrado buena correlación con resultados obtenidos en agar centeno B (Straub et al., 1979; Bruin y Edginton 1981; Crute, 1987). Sin embargo, gran parte de las investigaciones que han utilizado folíolos o discos de hojas para verificar resistencia a metalaxil, han generado resultados que tienen alta correlación con aquellos obtenidos in vitro (Walker y Cooke, 1988; Shattock et al., 1990; Sozzi et al., 1992). En el presente trabajo, ocho de los aislamientos de P. infestans colectados durante la temporada 1999 demostraron una gran capacidad de esporulación sobre folíolos del cv. Cardinal tratados con 10 mg L-1 de metalaxil. Este mismo grupo de individuos presentó colonias con un desarrollo similar a sus testigos, cuando fueron establecidos sobre agar centeno B que contenía 10 mg L-1 de metalaxil. En ambos casos fueron calificados como resistentes de acuerdo con los criterios establecidos por Deahl y Demuth (1993).

La alta severidad alcanzada por P. infestans y el bajo nivel de control ejercido por la mayoría de los programas que incluyeron metalaxil durante la temporada 1997 en la IV Región de Chile, sugirió la necesidad de evaluar el grado de sensibilidad que presentaba la población del patógeno a este fungicida. Resultados obtenidos durante los ciclos de cultivo 1999 y 2000 permiten establecer por primera vez que poblaciones de P. infestans presentes en la IV y V Región de Chile, que estuvieron expuestas a numerosas aplicaciones de metalaxil durante cada temporada estaban formadas en su totalidad por aislamientos resistentes a este fungicida. Durante las dos temporadas que incluyó el estudio, los aislamientos presentaron un alto nivel de resistencia in vitro (CE 50 > 233 mg L-1 de metalaxil) comparables con los reportados por Sozzi y Staub (1987) y por Walker y Cooke (1988).

En la IV y V Región de Chile, durante su primera etapa de uso, el metalaxil fue aplicado solo, ejerciendo probablemente una alta presión de selección contra la población natural, formada predominantemente por aislamientos sensibles al fungicida (Goodwin et al 1992). Autores como Cohen y Reuveni (1983), Holmes y Channon (1984) y Kadish y Cohen (1988), sugirieron que los aislamientos resistentes estaban presentes en muy baja frecuencia en las poblaciones naturales de P. infestans.

El presente estudio no detectó aislamientos sensibles en ninguna de las dos temporadas, probablemente esto se debió a las aplicaciónes del fungicida previo a la obtención de las muestras, o, en función del sistema de monocultivo en que se establece la especie S. tuberosum en ambas regiones, lo cual podría facilitar la mantención permanente de una población del patógeno dominada completamente por individuos resistentes.

LITERATURA CITADA

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Fernando Riveros B.2 Rodrigo Sotomayor2, Viviana Rivera3, Gary Secor3 y Boris Espinoza3

2 Instituto de Investigaciones Agropecuarias, Centro Regional de Investigación Intihuasi, Casilla 36/B, La Serena, Chile. 3 North Dakota State University, Departament of Plant Pathology, Fargo, North Dakota 58105, USA.