PROCESO DE SÍNTESIS Y OPTIMIZACIÓNi) elegir entre OPERACIONES alternativas
ii) diseño de una SECUENCIA ÓPTIMA para obtener máximo rendimiento con el menor número de pasos – Existen muchas alternativas y en diferente orden (es un problema de combinatoria) Objetivo de este paso es explotar al máximo las propiedades fisicoquímicas que diferencian al producto deseado del resto de los productos “contaminantes” de la manera más económica Definir las operaciones y secuencia de separación
(Gp:) ¿Cuáles son las OPERACIONES alternativas?
1.- 2.- 3.- 5.-
2. DISRUPCIÓN CELULAR Y SEPARACIÓN DE RESTOS CELULARES La técnica más recomendada para alta escala son los homogeinizadores (Gaulin homogenizer) – Homogeinización: – suspensiones celulares 15-20% (peso seco) – concentración celular no afecta la eficiencia – es necesario refrigerar (4-5ºC) – Modelos más grandes 6,000 L/h (levaduras y bacterias)
Molinos de perlas pequeñas perlas de vidrio (0.3-0.4mm ?) – diferentes diseños de agitadores – concentración de células afecta la eficiencia concentración óptima ? 30-60% peso húmedo modelos mas grandes 2000 L/h Ruptura química o enzimática limitado a baja escala (Lysozyme, Triton, otras)
1.- Remoción celular: Centrifugación – filtración
Separación de restos celulares centrifugación (no adecuada) ultrafiltración (300,000 – 500,000 o mayor) Microfiltración (0.1? m.) partición en dos fases acuosas (células rotas y restos quedan en la fase inferior) CDR (cell Debris Remover: Whatman) 3. CONCENTRACIÓN Los productos deben concentrarse hasta 10-50 veces. Técnica preferida : Ultrafiltración – partición líquido-líquido. Extracción con solventes – Precipitación (sulfato de NH4) -Evaporación – Destilación
5.- PURIFICACIÓN DE ALTA RESOLUCIÓN
– Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) -Cromatografía de intercambio iónico de alta resolución – Cromatografía de afinidad – Cromatografía metal quelante (IMAC) . Otras cromatografías: dye-ligand chromatography (triazine-colorante) 6. ACABADO esterilización y estabilización del producto deshidratación, liofilizado, estabilización (sales) 4.- PRETRATAMIETNO O EXTRACCIÓN DEL PRODUCTO Adsorción Intercambio iónico Cromoatografía de intercambio hidrofóbico
PROCESO DE SÍNTESIS Y OPTIMIZACIÓN
i) elegir entre OPERACIONES alternativas
ii) diseño de una SECUENCIA ÓPTIMA para obtener máximo rendimiento con el menor número de pasos – Existen muchas alternativas y en diferente orden (es un probelma de combinatoria) ¿Cómo elegimos las operaciones y secuencias?
Solución rigurosa o solución algorítmica Resuelve qué operaciones son apropiadas pero NO SECUENCIA
Utilización de las reglas de oro de la purificación – Método Heurístico. Resuelve las OPERACIONES y la SECUENCIA
3. Uso de TECNICAS DE INTELIGENCIA ARTIFICIAL: SISTEMAS EXPERTOS (SE) – utilizan el conocimiento empírico escanean toda la información acerca de las propiedades de la muestra y las operaciones toma en cuenta las reglas de oro de la purificación utilizan correlaciones matemáticas y bases de datos Encuentran una solución óptima al problema del proceso de purificación y la secuencia
Utilización de métodos numéricos clásicos, ecuaciones de diseño.
Resuelve el punto de OPERACIONES permitiendo elegir entre operaciones alternativas.
Emplea técnicas de programación matemática. Crean un diagrama de flujo que contiene todas las posibles alternativas de diseño 1.- Solución rigurosa o solución algorítmica
Utilización de las reglas de oro de la purificación – Método Heurístico.
Resuelve OPERECIONES Y SECUENCIAS
Emplea reglas desarrolladas a través
Diseños previos y experiencia exitosas de otros procesos Antecedentes del mismo proceso Sentido común
2. Utilización de las reglas de oro de la purificación
REGLA 1 “Elegir procesos de separación basados en diferentes propiedades físicas, químicas o bioquímicas”
REGLA 2 “Separar las impurezas más abundantes primero”
Es importante eliminar el agua en las primeras etapas del proceso. Tratar de reducir el material de trabajo hasta un 90% del volumen inicial
REGLA 3 “Seleccionar un procesos que permita aprovechar al máximo las diferencia entre las propiedades fisicoquímicas del producto y los contaminantes. – Se deben conocer las propiedades del producto y de las principales impurezas REGLA 4 “Realizar las separaciones más caras y difíciles al final” KEEP IT SIMPLE!
Propiedades de las proteínas a tener en cuenta en los proceso de separación y purificación Propiedades físico – químicas Punto isoeléctrico Carga, curva de valoración Tamaño, PM Especificidad por ligandos Propiedades de superficie (hidrofobicidad) Estabilidad Ejemplo REGLA 1 REGLA 1 “Elegir procesos de separación basados en diferentes propiedades físicas, químicas o bioquímicas”
Distribución de PM
(Gp:) 20 40 60 80 100 120 140 160 (Gp:) 100 (Gp:) M. W. ´s (x103) (Gp:) 90 (Gp:) 80 (Gp:) 70 (Gp:) 30 (Gp:) 60 (Gp:) 50 (Gp:) 40 (Gp:) 20 (Gp:) 10 (Gp:) 0 (Gp:) Number of Proteins
Distribución de PIs (Gp:) pI (Gp:) 1 (Gp:) 2 (Gp:) 3 (Gp:) 4 (Gp:) 5 (Gp:) 6 (Gp:) 7 (Gp:) 8 (Gp:) 9 (Gp:) 10
10 30 40 50 20 60 70 Number of Proteins Características fisicoquímicas de las principales proteínas de E. Coli
Operaciones de Separación y Purificación de proteínas en gran escalaMétodos de Recuperación y purificación y las correspondientes propiedades físicoquímicas involucradas en la operación
Operation
Physico-chemical property
Centrifugation
Sedimentation Velocity
Filtration Particle size Microfiltration
Particle size Homogeneization
Intracellular nature (pressure gradient)
Bead milling
Intracellular nature (liquid/solid shear)
Ultrafiltration
Mol ecular size
Two phase extraction
Partition coefficient Precipitation
Solubility (hydrophobic interaction)
Adsorption
Van der Waals forces, H bonds, polarities, dipole moments
Ion – exchange
Charge (titration curve)
Hydrophobic interaction
Surface hydrop hobicity
Affinity chromatography Biological affinity
Gel filtration
Molecular size Reversed phase liquid chromatography Hydrophilic and hydrophobic interactions
SINTESIS DE UN PROCESO DE BIOSEPARACIÓNaproximación Heurística 1. SEPARACIÓN CELULAR 6 ACABADO 5. PURIFICACIÓN DE ALTA RESOLUCIÓN 4. PRETRATAMIENTO REMOCIÓN DE RESTOS CELULARES Y DESECHOS 2. DISRUPCIÓN CELULAR Intracelular Extracelular 3. CONCENTRACIÓN PASOS 1. Desarrollar un diagrama de bloques con las principales etapas 2. Seleccionar para cada etapa las operaciones alternativas tratando de emplear las reglas remoción del componente más abundante Es muy importante la elección del PASO INICIAL, ya que es el que debe eliminar la mayoría de los contaminantes. Los pasos subsiguientes son empleados para eliminar los contaminantes de menor importancia
3. Uso de TECNICAS DE INTELIGENCIA ARTIFICIAL: SISTEMAS EXPERTOS (SE) – utilizan el conocimiento empírico escanean toda la información acerca de las propiedades de la muestra y las operaciones toma en cuenta las reglas de oro de la purificación utilizan correlaciones matemáticas y bases de datos
Encuentran una solución óptima al problema del proceso de operaciones y la secuencia
Base de datos. Conocimiento requerido para solucionar el problema específico. Reglas de purificación. Conocimiento empírico. Motor deductivo. Es el programa que utiliza el conocimiento para tomar decisiones. Permite la comunicación entre el conocimiento y el programa. Secuencia de operaciones en un proceso downstream y la comparación entre varios métodos de separación en términos de costos y eficiencia
ii) Escala de operación Ver la compatibilidad entre la operación y la escala en la cual se va a diseñar Analizar el límite que poseen las operaciones elegidas
iii) Número de etapas Debe considerarse en el diseño si los procedimientos seleccionados requieren de alguna etapa de regeneración, elusión del producto deseado, etc iii) Costos costos de operación Costos fijos Gastos de planta administración (impuestos) Investigación y desarrollo
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