Mecanismos fisiológicos de inmunidad en Insectos (página 2)

2. RECONOCIMIENTO DEL SISTEMA INMUNOLÓGICO DEL INSECTO

El mecanismo de inspección que desarrolla el sistema inmunológico en insectos, permite la detección de moléculas, cuerpos o partículas extrañas. El reconocimiento de estos elementos estimula las respuestas defensivas en el insecto (Gillespie et al., 1997).

La respuesta ejercida por los hemócitos ante una invasión externa de las características mencionadas al interior del hemocele, hace necesario que las células distingan completamente a dicho microorganismo invasor de los tejidos del propio insecto (Tanada y Kaya, 1993).

Esto proceso se denomina reconocimiento de sí mismo y requiere que el microorganismo invasor pueda ser reconocido de las superficies de los tejidos del hemocele por sus propiedades físicas y/o químicas. Por lo general los insectos han desarrollado sistemas de reconocimiento de patrones moleculares característicos de polisacáridos microbianos presentes en la pared celular como: peptidoglicanos, abundantes en bacterias gram positivas; liposacáridos en la membrana externa de bacterias gram negativas y finalmente b -1,3 glucanos en la pared celular de los hongos.

Así mismo en la hemolinfa del insecto contiene moléculas especializadas de reconocimiento de esos poli o oligosacáridos que se ligan a las partículas o estructuras del patógeno invasor. La producción de esas partículas de reconocimiento frecuentemente se encuentra en el tejido gorduroso y es estimulada con la infección provocada por el organismo patógeno invasor. Ese reconocimiento lo ejercen prácticamente receptores péptidos o proteínas como lectinas, hemocitina, hemolina. Las lectinas o hemaglutinos son proteínas multiméricas de la hemolinfa (unidades con 30-40 kDa), que representan gran importancia, por aglutinar eritrocitos como se especificará mas adelante. La hemocitina es un tipo diferente de lectina, semejante al factor agregador de las plaquetas de vertebrados, que después de ser formadas, presentan un tamaño de 280kDa. Estimula la agregación de los hemócitos y su producción es estimulada en hemócitos, por bacterias o componentes de la pared celular de estas. En cuanto a la hemolina, otra proteína de la hemolinfa parece tener un papel trascendental en el reconocimiento inmunológico e modulación en la respuesta defensiva de H. cecropia y M. sexta. Se liga a la superficie de las bacterias y los hemócitos, regulando la actividad adhesiva y fagocita de los hemócitos (Gillespie et al., 1997).

Por otra parte, aún no se ha establecido que mecanismos de reconocimiento utiliza el sistema inmunológico del insecto para contrarrestar a los patógenos. Marmaras et al., (1994) identificó uno de los mecanismos que determina acción del sistema inmunológico de E. colli en C. capitata.

Inicialmente se aisló la proteína (47Kda), tirosina, hemócitos de la hemolinfa del insecto, después de haber sido infectado por la bacteria, donde se encontró que el polipéptido 47Kda junto con derivados de la tirosina, hacen que la propia tirosina ataque la superficie de la bacteria o estimule a los hemócitos a atraparla y la posterior formación de nódulos. Al complejo responsable de esta acción se le denominó complejo proteínico E.colli-47Kda (Chapman, 1998).

Asgari et al., (1998) enfatiza que los insectos parasitoides han desarrollado adaptaciones evolutivas, donde los huevos producidos para la oviposición en un hospedero, han desarrollado un sistema inmune que evita su reconocimiento inicialmente por el hospedero y posteriores reacciones de inmunidad celular. En principio se determinó que la superficie de dichos huevos presenta la proteína 32kDA y otras partículas de polinavirus en una asociación, que garantiza un sistema defensivo ante su encapsulación.

Se ha observado que algunas de estas respuestas defensivas pueden provenir también de los carbohidratos que se incorporan en las superficies de las bacterias y hongos. Por ejemplo, b 3-1,3-glucanos están presentes en las paredes de muchas especies de hongos, y lipopolisacáridos o peptidoglicanos en las paredes celulares de las bacterias. Estos compuestos estimulan la fagocitosis o la activación de la profenoloxidasa. Es probable que las lectinas del insecto actúan recíprocamente con estos compuestos y realicen fagocitosis de estas partículas extrañas (Chapman, 1998).

En general, los granulócitos parecen estar involucrados en las fases iniciales de reconocimiento de tejido o de partículas extrañas. Degranulación de estas células ocurre ciertamente en las fases iniciales de formación del nódulo y encapsulación. En Bombyx mori (Lepidóptera: Bombicidae), una proteína que actúa recíprocamente con la b -1,3-glucano se presenta en los gránulos de los granulócitos y en la hemolinfa (Ochiai, Niki y Ashida, 1992 citados por Chapman, 1998). Como consecuencia de la interacción de los granulócitos con el microorganismo invasor, se estimula a la atracción de los plasmatócitos a ese lugar.

La efectividad de la fagocitosis por los plasmatócitos en la larva de Galleria mellonella (Lepidotera: Piralidae) ó polilla de cera, se refuerza por la presencia de granulócitos. Además, los plasmatócitos de larvas de G. mellonella que están activamente fagocitando, producen un factor que estimula la actividad fagocítica de otros plasmatócitos (Anggraeni y Ratcliffc, 1991).

3. HEPATOLOGÍA

En general, los insectos presentan mecanismos de defensa innatos desarrollados para contrarrestar el desarrollo de las enfermedades en el hemocele. Esta resistencia esta asociada a reacciones celulares y acelulares (humorales). La inmunidad celular y humoral están interrelacionadas donde las células segregan factores humorales y estos son involucrados en actividades celulares como fagocitosis y encapsulación (Tanada y Kaya, 1993). Las células de sangre o hemócitos, y los diferentes tipos de estos van a determinar en gran parte, una serie de respuestas defensivas, dependiendo de la naturaleza del invasor y de la especie del insecto.

3.1 DEFENSA CELULAR

Cuando un microorganismo denominado parásito o patógeno vence las barreras naturales de los insectos y penetra en su hemocele, se desencadena una serie de eventos involucrados dentro de la defensa celular que desarrolla el insecto ante ese invasor extraño. Inicialmente estos procesos de defensa se manifiestan por las heridas ocurridas en el hemocele o por una infección desarrollada en la hemolinfa del insecto, generándose una serie de respuestas de reacción como son la fagocitosis y la encapsulación de los agentes infectivos y determinando cambios en las cantidades de los hemócitos, como efectores de esa reacción de respuesta (Moto y Alves, 1998)

En los estados larvales de los insectos y en los adultos de especies hemimetábolas, las heridas e infecciones producen un declive rápido en la cantidad de los hemócitos, pero esta tendencia vuelve a su nivel original después de una hora y puede elevarse la cantidad por encima del nivel normal durante un día. Si, en un momento determinado el insecto está herido, los microorganismos patogénicos entran en el hemocele y la cantidad celular de dichos hemócitos no se recupera para un periodo más prolongado.

La reducción súbita resulta de la disminución de los plasmatócitos de la circulación en la hemolinfa. Después de cinco minutos de que la larva de G. mellonella fuera infectada favorablemente por una bacteria altamente virulenta como Bacillus cereus, los plasmatócitos prácticamente desaparecen de la sangre. Estos generalmente constituyen el 50°/o de la población del hemócitos de la hemolinfa. Otras bacterias patógenas menos virulentas, también producen un declive rápido en el número de plasmatócitos, aunque el efecto es menos marcado. Cantidades de otro tipo hemócitos generalmente no presentan afección por estos procesos de infección (Chaín y Anderson, 1982).

La reducción en las cantidades de plasmatócitos puede ser el resultado de una tendencia mayor de adherencia de los hemócitos a otros objetos o estructuras, como sus propios tejidos interactuando al mismo tiempo que el microorganismo invasor. En el último caso esta conducta es asociada con el nódulo o la formación de la cápsula y las bajas cantidades de hemócitos asociados a la bacteria patogénica, es probablemente la razón del porque muchas células se adhieren a la cápsula.

Un aumentó del número de hemócitos para ligarsen con lectinas después de una herida o infección por el hongo Beauveria bassiana, efecto demostrado varias especies de insectos. Mientras una simple herida es un evento efímero, el hongo tiene un efecto sostenible y un tiempo de pleno desarrollo (Miranpuri y Khachatourians, 1993 citados por Chapman, 1998).

También es probable que la mortalidad de los hemócitos en la hemolinfa es producida por las toxinas secretadas por las bacterias o hongos patógenos invasores.

La respuesta de los hemócitos en pupas de Lepidoptera es muy diferente. Aquí el aumento en el número de células es diez mayor una vez ha ocurrido la herida transcurrido un periodo de una hora, y esta cantidad de células se mantiene elevada durante varios días.

1. HEMÓCITOS

Son un complejo de muchos tipos de células especializadas que circulan suspendidos en el plasma con la hemolinfa pero algunas veces están ligados a otros tejidos o enmascarados en ellos. Son células nucleadas y presentan formas amebiodes y pleomórficas, sufriendo divisiones mitóticas, asemejándose a pequeños plasmatócitos, garantizando su permanencia y cantidad requerida en la hemolinfa, siempre que haya actividad fenoloxidasa, de acuerdo a estudios realizados en Drosophila melanogaster (Rizki y Rizki, 1984)

Se han descrito diferentes tipos de hemócitos, cuya naturaleza no ha sido del todo establecido, pero su variabilidad depende de la especie del insecto, de la edad, y la mutabilidad que los hemócitos sufren con base a reacciones específicas defensivas (Tanada y Kaya, 1993). Éstas células individuales pueden tener formas diversas y se han implementado diversas técnicas para su estudio. Rowley y Rateliffe (1981) y Gupta (1979a, 1979h, 1985, 1991) citados por Chapman (1998), intentaron realizar una clasificación inicial, agrupando hemócitos por sinonimia de formas y colocarlos en seis tipos principales entre los cuales se encuentran pro-hemócitos, plasmatócitos, granulócitos.

• Plasmatócitos: También denominados como amebócitos, pobócitos, lamelócitos y fagócitos presentan diferentes formas y dimensiones, de 3 a 45m m, siendo ampliamente pleomórficos (Tanada y Kaya, 1993; Omoto y Alves, 1998). De acuerdo Rizki y Rizki (1984), los plamatócitos son muy inconstantes en su forma y contienen cantidades moderadas de retículo endoplasmático rugoso, complejos de Golgi y presentan una gran variedad de inclusiones como vesículas endocitóticas, lisosomas, cuerpos residuales y lamelares las células presentan nucleolos prominentes y cantidades de cromatina difusa.

Estos son los hemócitos más abundantes encontrados en la hemolinfa y normalmente constituyen más del 30% de la cuenta total de hemócitos. Plasmatócitos algunas veces se presentan en cápsulas de allí que se encuentren involucrados en procesos de fagocitosis y encapsulación de organismos extraños que invaden el hemocele (Tanada y Kaya, 1993; Chapman, 1998).

• Las células de Spherule: Son caracterizadas por poseer spherules grandes, retráctiles que puede ocupar cerca del 90% del citoplasma. Normalmente no son muy comunes sin embargo se han encaminado estudios para establecer su procedencia y función (Chapman, 1998).
• Enocitoides: Son esféricos y alongados, de 16 a 45m m hialinos con un sistema filamentoso en el citoplasma (Omoto y Alves, 1998). Ocurren principalmente en Lepidoptera dónde ellos representan la más grande proporción de hemócitos. Estas células exhiben desarrollo pequeño de organelos como retículo endoplasmático rugoso y complejos de Golgi, sin embargo estos oenocitoides tienen una serie compleja de microtúbulos y a veces también las inclusiones cristalinas (Chapman, 1998).

Su función es desconocida, sin embargo se cree que están involucrados en el desarrollo de complejos de células granulares y pueden ser originados de plasmatócitos (Tanada y Kaya, 1993). En mosquitos, estos están involucrados en la producción de melanina (Drif y Brehélin, 1983 citados por Tanada y Kaya, 1993).

• Granulócitos: También denominados ádipo-hemócitos, miden de 10 a 45m m y están involucrados con procesos de fagocitosis como se establecerá mas adelante. Contienen cantidades grandes de reticulum endoplasmático que a menudo se dilata extensivamente (Omoto y Alves, 1998). Los cuerpos de golgi con complejos abundantes y las células contienen grandes cantidades de gránulos en los límites de la membrana celular. Ellos comprenden una proporción considerable, normalmente más de 30% de la población de los hemócitos. Ellos descargan sus volúmenes en las superficies de los organismos que invasores como una temprana respuesta defensiva. De allí que en muchos insectos desempeñen funciones fagocíticas (Tanada y Kaya, 1993). Granulócitos son derivados de los plasmatócitos.
• Cistócitos: Probablemente son granulócitos donde la síntesis de volúmenes granulares fue completa. Ellos contienen gránulos abundantes, pero normalmente contiene cantidades más pequeñas de complejos de Golgi y de retículo endoplasmático rugoso que los granulócitos. Ellos poseen grandes núcleos en alta proporción dentro del citoplasma. Ellos son a menudo comunes, encontrados en Díptera, Lepidóptera y Himenóptera (Chapman, 1998).
• Podócitos:Es una variación de los plamatócitos, caracterizados por filamentos proyectados o extensiones de la membrana de la superficie citoplasmática. La disposición intracelular sus los órganelos, es lo que lo diferencia morfológicamente de los plasmócitos. Por ello se consideran una variación morfológica de los mismos plasmatócitos, pero con rasgos característicos (Rizki y Rizki, 1984).
• Prohemócitos: Son esféricos o alongados, de 6 a 14m m se caracterizan por un alta proporción nuclear citoplásmica y una falta general de organelos involucrados en su síntesis (Omoto y Alves, 1998). Ellos raramente comprenden más del 5% de la población del hemócitos en total. Ellos son células germinales y son considerados como la fuente para la multiplicación de hemócitos postembrionales y hacen parte de las células básicas de la constitución de la mayoría de los otros tipos del hemócitos (Tanada y Kaya, 1993; Chapman, 1998).
• Lamelócitos: Estos forman las paredes de las cápsulas que envuelven los cuerpos extraños que penetran al hemocele, y la morfología de estas células es determinada para dicha función. Pueden llegar a tener un diámetro entre 50-60m m y menos de 0,2m m en sus extremos. Son derivados de los plasmatócitos y cuanto decrece la cantidad de estos por un inusual decrecimiento en la actividad mitótica, lamelócitos y podócitos aumentan su cantidad en la hemolinfa (Rizki y Rizki, 1984).
• Coagulócitos: También denominados cistócitos son células polimórficas frágiles. Son esféricos, hialinos, de 3 a 30m m, con núcleo en forma de rueda y con función de ser un pre-coagulante (Omoto y Alves, 1998). Adicionalmente ellos participan activamente en funciones de fagocitosis, encapsulación celular y en la formación de nódulos (Rowley y Ratcliffe 1981, citados por Tanada y Kaya, 1993).
• Adipohemócitos: Característicamente son células compactas y ovoides. Usualmente son muy pequeñas presentando diámetros de 7 a 45m m y el núcleo localizado en un amplio volumen de citoplasma definitivamente puede variar en tamaño (4 a 10m m). Los núcleos de estas células pueden ser cóncavos, biconvexos, puntados o lobados. Los adipohemócitos se pueden identificar en la hemolinfa como gotículas (droplets) de lípidos y en su interior presentan retículos endoplasmáticos bien desarrollados al igual que complejos de Golgi. (Tanada y Kaya, 1993; Chapman, 1998).
• Formas intermedias: En el momento de formación de los tumores melanóticos, se pueden apreciar formas intermedias o transicionales entre plasmatócitos, podócitos y lamelócitos (Rizki y Rizki, 1984). En algunas especies de insectos, puede presentarse pocos lamelócitos, pero en tumores melanóticos es común la ocurrencia de lamelócitos y formas intermedias como las referenciadas anteriormente.

3.1.1.1 ORIGEN DE LOS HEMOCITOS

Los hemócitos se derivan de mesoderma embrionario. Como consecuencia, los nuevos hemócitos son producidos por las divisiones mitóticas de hemócitos existentes, o de células no diferenciadas en estructuras conocidas como órganos hemopoiéticos (Chapman, 1998).

3.1.1.2 DIVISIÓN MITÓTICA DE LOS HEMÓCITOS

La producción de nuevos hemócitos por la mitosis de las células de sangre existentes, es un fenómeno ampliamente conocido. En los insectos adultos holometábolos en los cuales falten los órganos hemopoiéticos, los nuevos hemócitos sólo pueden ser producidos de esta forma. Éste también parece ser el caso que puede acontecer durante las fases larvales de Oncopeltus.

Por otra parte, la producción de hemócitos de las células existentes parece complementar la producción que realizan los órganos hemopoiticos, pero dónde los órganos hemopoiéticos persisten en insectos adultos, como en Blattodea y Ortóptera, la división mitótica de hemócitos existente, es relativamente rara (Chapman, 1998).

No todos los tipos de célula hemóticas se dividen y las proporciones de división incluso varían entre ellas Pro-hemócitos se encontraron entre un 0.2 y 0.4% en la división en las muestras de sangre tomadas durante las primeras cuatro fases de desarrollo larval de la polilla, Euxoa, pero este nivel declinó en la fase larval final. La actividad mitótica era similar en granulócitos, pero aumentó de cero en las primeras dos fases a aproximadamente 0.25% en la última fase entre las células de spherule. Plasma tocitos ocasionalmente se dividen en la mayoría de los insectos. A pesar de esto, el número de plasmatócitos por unidad de volumen de la unidad de hemolinfa se incrementa a lo largo del desarrollo larval. Ellos probablemente se derivan del prohemócitos que permanecen constantes en la relativa abundancia a pesar de la proporción de la alta tasa mitótica (Chapman, 1998).

Las tasas mitóticas para todas las células que sólo excede el 1%, pero otros trabajos indican tasas de división más altas. Arnold y Hinks (1983) citados por Chapman (1998), sugieren que en la fase larval final de Euxoa, los índices mitóticos de las células spherule pueden exceder 10% y en la fase larval final de oncopellus, se registró un índice mitótico del 4%.

Sobre la base de la actividad mitótica de las células, se ha sugerido que la población de granulócitos de la población en la última fase larval de Euxina cesó al final del estado larval, a los 5 días; células de Spherule aumentaron su población celular volvería a incrementarse en menos de un día (Arnold y Hinks, 1983 citados por Chapman, 1998).

3.1.1.3 ÓRGANOS HEMOPOIÉTICOS DE SANGRE

La sangre es formada en estructuras denominadas órganos hemopiéticos. Subsecuentemente en los insectos, sólo la sangre se produce en dichas estructuras mas no el plasma. Se han descrito los órganos hemopoiéticos en Orthoptera, en larvas de Lepidóptera, Díptera y Coleóptera. Ellos persisten en el estado adulto de Ortóptera, pero no en los adultos de las demás especies de holometábolos. Ningún órgano hemopoiético está presente en cualquier fase del bicho del Oncopeltus (Chapman, 1998).

Dentro de los órganos hemopoiéticos se forman células reticulares en una matriz del tejido conjuntivo. Estas células sufren divisiones mitóticas y dan lugar a hemócitos. De esta manera también se forman granulócitos y plasmatócitos. Ellos se separan de la región cortical y entran en la circulación de la sangre, probablemente hacia el corazón. Las células reticulares también poseen los fagocitos, que toman el material extraño de la hemolinfa. Debido a este proceso se llamaron órganos hemopoiéticos originalmente se denominaron órganos fagocíticos (Feir, 1979; Hoffman et al, 1979 citados por Chapman, 1998)

3.1.1.4 ESTIMACIONES DE HEMOCITOS EN LA SANGRE

Del número total de hemócitos en una muestra de sangre de un insecto, los más pequeños tienen menos hemócitos que los insectos grandes. Las hembras adultas de mosquitos tienen un total de menos de 10000 hemócitos, considerando que adultos tienen más de 9000000. Tendencias similares ocurren dentro de una especie. El segundo estadio larval de Euxoa tiene aproximadamente 4000 hemócitos; el sexto estado larval tiene aproximadamente 2400000.

El número también puede variar cíclicamente. Por ejemplo, en el último estado larval de la polilla de cera, G. mellonella el número total de células está al principio constante, aproximadamente 2.2 millones y aumenta a casi 4 millones antes de que el insecto mude. Un aumento relativo aun más grande ocurre durante las fases del postalimentación de la fase final de la larva de Sarcophaga, pero en el momento de enpupamiento, cuando la larva se pone inmóvil, hay un declive rápido y súbito de los hemócitos (Chapman, 1998).

La reducción en el número de hemócitos puede ser el resultado de la muerte celular o de un aumento de los hemócitos que se adhieren a los tejidos.

Las cantidades del número de células por unidad de volumen en la hemolinfa no puede reflejar el número total de hemócitos en la circulación porque su volumen en la sangre varía. Por ejemplo, en la última fase larval de G. mellonella, cuando el número total de células es constante, su número por unidad de volumen disminuye porque el volumen de la sangre está aumentando. De un punto de vista funcional, como cicatrización de una herida o la defensa contra microorganismos invasores, el número por unidad de volumen de hemócitos puede ser más importante que su número total.

El número de hemócitos por la unidad de volumen de la sangre tiende a aumentar a lo largo del desarrollo larval, pero con una variación adicional dentro de cada fase de desarrollo. Alcanza un número máximo en el momento de cada ecdisis, exceptuando la ecdisis de pupa a adulto. La falta de un incremento en este momento puede reflejar el hecho que una reestructuración mayor de los tejidos ocurre antes en el periodo del pupal. En los insectos hemimetábolos, las cantidades de hemócitos son generalmente similares en larvas y en insectos adultos, pero en las especies holometábolas es usual para las larvas tener más células por unidad de volumen en la sangre que en los adultos. En general, las hembras adultas tienen un número más alto de hemócitos que los varones (Chapman, 1998).

3.1.1.5 PERFIL DE LOS HEMÓCITOS

La abundancia relativa de diferentes tipos de hemócitos no es constante. Plasmatócitos y granulócitos normalmente son los más abundantes, estableciendo a menudo más de 50% de la población total hemócitos. La abundancia relativa de plasmatócitos tiende a reducirse y aumentar el número granulócitos, a través del periodo larval, pero un caso inverso a este proceso ocurre durante el enpupamento en Surcophaga, cuando la cantidad total de hemócitos es reducida. Cantidades relativas de otros tipos de la célula también cambian; las células de spherule virtualmente desaparecen de la sangre de Sarcophaga en el enpupamento. En Rhodnius, los cambios en la abundancia relativa de los hemócitos ocurren, durante la alimentación y la muda. (Shapiro, 1979 citados por Chapman, 1998)

3.1.1.6 FUNCIONES DE LOS HEMOCITOS

Los hemócitos realizan una variedad de funciones. La reparación de tejidos y defensa contra microorganismos parásitos y patógenos, se encuentra como las principales funciones.

Granulócitos y células de spherule en la larva de Calpuode, promueven la síntesis de polipeptidos los cuales son secretados en la hemolinfa y consecutivamente son incorporados en la cutícula. Otros péptidos producidos por los hemócitos probablemente se agregan a la lámina basal (Sass, Kiss y Locke, 1994).

Los hemócitos contienen muchas proteasas, algunas de los cuales parecen estar involucradas en la separación de tejidos durante la metamorfosis. Por ejemplo, algunos hemócitos de Sarcophaga tienen una proteína de 200kDa en la membrana celular. Estas células aumentan en su número en el momento de la formación de la pupa y la proteína de 200kDa, se liga a los lugares en la lámina basal del cuerpo gorduroso. Aquí las células segregan una proteasa que disocia el cuerpo gorduroso (Kurata, Saito y Natori, 1993 citados por Chapman, 1998).

Si la epidermis es dañada, un grumo de sangre se forma bajo la herida. La formación del grumo involucra los componentes del hemócitos y el plasma. Granulócitos descargan el material del cual se forma un gel. Este gel es estabilizado por lipoforinas del plasma y por fenoloxidasas de los hemócitos. No son conocidas las causas del porque las células cambian de sitio en el momento de la infección y se degranulan, pero posiblemente algún factor de lesión, produce algún tipo de daño a la lámina basal.

Algún tiempo después que la coagulación ha ocurrido, los plasmatócitos emigran a ese lugar. De esta manera, la unión de hemócitos forma un tejido continuo. Posteriormente las células epidérmicas emigran encima del grumo para reparar la herida (Chapman, 1998).

3.1.1.7 RESPUESTA DE HEMÓCITOS A AGENTES BIÓTICOS

La respuesta inmunológica celular puede ser modulada por una serie de factores endógenos, reguladores de la fisiología general de los insectos. Cambios en le número de hemócitos que ocurren en los ciclos entre las mudas del insecto, son posiblemente regulados por hormonas reguladoras de desarrollo en insectos. Puede atribuirse a que las hormonas que promuevan la transformación de los hemócitos de una forma inactiva a una forma activa tornándolos receptivos a señales activadoras en ciertos estadios de diferenciación. La muda y la metamorfosis son los estados críticos en los que los insectos son más susceptibles a las infecciones y existen varios ejemplos demostrando alteraciones en la fisiología de los componentes de hemócitos con relación a la metamorfosis y la influencia hormonal (Gillespie et al., 1997).

Por otra parte cuando se presentan variaciones en la efectividad de la inmunidad celular en respuesta a los agentes patógenos se presenta respuestas defensivas por parte de los hemócitos. Cuando partículas no viables son inyectadas, el número de partículas que las digieren es relativamente alto (índice fagocítico), pero con los patógenos este índice puede ser insignificante por su variabilidad. Cuando pequeñas cantidades de bacteria son inoculadas en el hemocele, son rápidamente removidas de la hemolinfa por hemócitos adhesivos que los digieren, pero cuando grandes cantidades de bacteria son inoculadas, ellas son dramáticamente reducidas por nódulos. Algunas bacterias son destruidas por fagocitosis de hemócitos circulantes. La inmunidad celular puede ser inefectiva, cuando se presenta una invasión masiva de patógenos. La variabilidad puede estar asociada a alguna condición no específica en el insecto, que limita su capacidad de respuesta extrínsecos, como la virulencia del patógeno, la dosis etc. Otros factores que pueden actuar son la temperatura, radiación etc., pero en especial la influencia de la inmunidad celular (Tanada y Kaya, 1993).

3.1.2 MECANISMOS DE INMUNIDAD CELULAR

Un simple daño de la epidermis, incluso sin infección, es suficiente para inducir algunos incrementos en las cantidades proteínas hemolínficas, cuyo el efecto se refuerza grandemente por el tipo de infección, el cual es reconocido por el sistema de defensa del insecto, presentando una serie de mecanismos o reacciones de defensa entre las cuales se tiene:

• Fagocitosis: Es la respuesta primaria de hemócitos a partículas pequeñas como bacterias. En este proceso los hemócitos forman seudópodos, estructurando los fagocitos. Estos penetran en la epidermis, glándulas endocrinas, epitelio traqueal, glándulas salivares, parte del canal alimentario, tubos de malpigi, células pericardiales, cuerpo gorduroso y los músculos.

De acuerdo con Gillespie et al., (1997) la fagocitosis envuelve filamentos de actina y puede ser inhibida por la acción de la citochalasina B.

Tanto los granulócitos que se encuentran fijos como los circulantes en la hemolinfa, se encuentran siempre activos removiendo y englobando las partículas extrañas existentes en la hemolinfa (Tanada y Kaya, 1993).

Las partículas fagocitadas, normalmente pequeñas son recubiertas por una vacuola fagocítica. Un microorganismo cuando es fagocitado puede ser destruido o multiplicar sus hemócitos y provocar la lisis, retornando al hemocele y constituyendo una septicemia (Omoto y Alves, 1998). Pequeñas cantidades de bacterias, esporas fungíferas, protozoos son fagocitados por los plasmatócitos. Microorganismos no patogénicos y los patogénicos son suprimidos y/o eliminados de esta forma, pero el proceso en si aún no es no conocido.

Proteínas presentes en la hemolinfa posiblemente con características bactericidas producidas por los hemócitos están involucradas en este proceso. Así mismo la fagocitosis juega un papel fundamental en la morfogénesis ya que destruyen, digieriren y remueven rápidamente tejidos y reutiliza los componentes celulares para la estructuración de nuevos tejidos durante la metamorfosis (Tanada y Kaya, 1993; Chapman, 1998).

Mediante la fagocitosis, se ingieren las partículas mediante tres vías: (1) formación de vesículas de pinocitosis que contienen un fluido con pequeñas partículas, (2) con seudópodos se atrapan y envuelven las partículas extrañas y (3) por un contacto totalmente próximo de lo pinositos cubriendo con su membrana plasmática las partículas extrañas (Salt 1970 citado por Tanada y Kaya, 1993). Por otra parte el proceso de fagocitosis involucra en general los siguientes pasos: (1) Reconocimiento por parte de los hemócitos de las partículas extrañas dentro del hemocele del insecto. (2) Atracción quimotáctica, donde los hemócitos son atraídos por las partículas extrañas. (3) Adherencia ocurre cuando la partícula se adhieren a la superficie de los hemócitos. Aquí están involucradas fuerzas fisicoquímicas en las moléculas receptoras de las partículas extrañas, estableciéndose lugares de unión con la superficie de los hemócitos. (4) Ingestión de la partícula ocurre cuando la pseudopodia o la membrana se invagina alrededor de la partícula y la encierra. En el citoplasma, la membrana contiene una vacuola fagocítica, procedente de la pared de la membrana celular original (Figura 8). (5) Degranulación resulta de la transformación de enzimas a partir de gránulos (lisosomas) dentro de la vacuola fagocítica. (6) Digestión de partículas ocurre por enzimas lisosomáticas y las partículas no digeridas son transformadas por exocitosis (Rizki y Rizki, 1984;Tanada y Kaya, 1993).

De acuerdo con Rizki y Rizki, (1984), en el caso de Drosophila melanogaster, al ser inyectada artificialmente la bacteria E. Colli, una vez en la hemolinfa, esta bacteria es atraída quimotácticamente a los plasmatócitos y se adhieren copiosamente a su superficie, formándose una cápsula para inicialmente ser ingeridas, y donde la vacuola fagocítica comienza a succionar el material bacterial, el cual por medio de enzimas termina digiriéndolo y formando parte del cuerpo plasmatócito.

Usualmente el término endocitosis, se ha utilizado para combinar tanto el proceso de la fagocitosis como el de pinocitosis. Endocitosis es el proceso por la cual la membrana plasmática esta involucrada, donde envuelve partículas insolubles que inicialmente fueron fagocitadas, haciéndolas solubles para finalmente ser pinocitadas (Tanada y Kaya, 1993).

La eficiencia de la inmunidad celular depende de la habilidad de reconocimiento de estas células de los componente propios y extraños del insecto, donde para el caso de G. mellonella existe una activación del sistema de profenoloxidasa al reaccionar a endotoxina bacterianas. Los granulócitos inducen a la hemolinfa a procesos de mecanización y coagulación de esos cuerpos extraños, y los plasmatócitos responden aportando una cuota de melanina en la superficie de esos cuerpos. En otros casos en insectos como en el gusano de seda (Bombyx mori) se ha observado la acción de factores humorales que promueven la elongación de la filodia (pseudofilodia) en los granulócitos (Tanada y Kaya, 1993).

La anulación del proceso de fagocitosis por los organismos patogénicos, puede depender de los diferentes mecanismos. Por ejemplo, cuerpos hifales del patógeno fúngico Nomuraea que es capaz de matar gran cantidad de estados larvales de Spodoptera, no son los fagocitados. Beauveria, otro hongo patógeno que es menos virulento, es fagocitado, sin embargo un tubo germinal puede desarrollarse y producir hifas (Hung, Boucias y Vev, 1993 citados por Chapman 1998). En el primer caso citado parece ser que las características superficiales del primer patógeno no son reconocidas por el insecto como un microorganismo extraño.

Para el segundo caso, Beauveria spp es reconocido, sin embargo este hongo produce factores immunosupresores que disminuyen la respuesta inmune del insecto. Finalmente los hemócitos más importantes en la fagocitosis son los plasmatócitos y los granulócitos, como las principales células fagocíticas en insectos y la fagocitosis frecuentemente deforma la apariencia del hemócito y la tasa de fagocitosis de estos es variable en función del hemócito, condiciones locales y características de la superficie de la partícula a ser fagocitada (Gillespie et al., 1997).

• Nodulación: Los nódulos son agregados hemocíticos multicelulares que pueden capturar un gran número de bacterias en un material extracelular. Esos agregados nodulares pueden adherir a los tejidos, nódulos mayores pudiendo ser eventualmente encapsulados. La formación de agregados de hemócitos puede ser inducida por lipopolisacáridos, zimosano, laminarina o algunas glicoproteinas. Algunas proteínas específicas están envolvidas en el desencadenamiento de este proceso, pudiendo ser producidas por los propios hemócitos, como por ejemplo la proteína de 47kDa obtenida en C. capitata, o por otras células como las epiteliales y las del intestino medio como la scolexina (Gillespie et al., 1997).

Por otra parte los nódulos formados cuando existen altas concentraciones de microorganismos invasores o cuando suspensiones de partículas inviables, son inoculadas al hemocele del insecto.

En un proceso que se desenvuelve rápidamente en el hemocele del insecto en menos de 24 horas donde lamelócitos, granulócitos, coagulócitos e plasmatócitos actúan rápidamente sobre grandes cantidades de partículas que invaden la hemolinfa, como se puede apreciar sobre un cuerpo gorduroso en D. melanogaster.

Se forman inicialmente masas necróticas, melanizadas, compuestas de hemócitos granulares más la partícula extraña (bacteria, etc) las cuales posteriormente son cubiertas por hemócitos (Omoto y Alves, 1998). Grandes cantidades de bacteria o esporas fungíferas son atacadas de esta manera, por la formación de éstos nódulos. Dentro de pocos minutos, se encuentran las bacterias atrapadas por un coagulo producido por numerosos granulócitos. En algunas especies de insectos, la melanización de granulócitos necróticos y la formación del coágulo empieza en los primeros cinco minutos.

Después de aproximadamente dos horas, los plasmatocitos llegan, se adhieren y empiezan a formar un tejido o capa alrededor del grupo de células invasoras. De acuerdo con Rizki y Rizki, (1984), en D.virilis este proceso puede llevar de 12 a 14 horas, hasta que se presenta el reconocimiento del agente bacterial. Posteriormente, como ya se espoecificó, una pequeña fagocitosis empieza a ocurrir, donde la intensidad de esta varía, dependiendo de la virulencia de los organismos invasores. Organismos altamente virulentos inducen una respuesta más fuerte y rápida de formas no patogénicas y existe evidencia de que la respuesta de la nodulación es modulada por eicosanoides (Miller et al 1996).

• Células gigantes: Células gigantes han sido observadas en insectos capturando bacterias invasoras. Estas células son multinucleadas, pero aún no es clara su procedencia, y se cree que pueden originarse de la fusión incompleta de algunos hemócitos (Whitcomb et al 1974, citado por Tanada y Kaya, 1993). Cuando el nematodo Abbreviata caucasica penetra las células epiteliales del insecto Blatella germanica comienza una reacción de envoltura de la célula syncitial gigante hacia el patógeno.
• Tumores: Lesiones melanóticas o tumores son producidos en respuesta a varios estímulos por dos tipos de reacciones: (1) Proliferación exagerada de células epiteliales, (2) encapsulación de tejido anormal por los hemócitos, cuando se encuentra una alteración cancerosa. Los tumores son producidos en los insectos por varios factores, como partículas virales, micoplasma, microsporodios, disturbios hormonales. Muchos tumores han sido observados en detalle en Drosophila melanogaster. (Tanada y kaya, 1993).
• Factores humorales: Algunos son de tipo bactericida, otros actúan como tóxicos de determinados parásitos causándoles la muerte al contacto con la hemolinfa del hospedero (Chapman, 1998). De acuerdo con Rizki y Rizki, (1984), bacterias de E. colli en la hemolinfa de D. melanogaster, el proceso de encapsulación una vez es digerida la partícula bacterial implica la ruptura de hemócitos, donde son liberadas enzimas altamente solubles, que estimula a la secreción de factores humorales como bacteriolisinas o opsoninas.
• Encapsulación: Es una relación en la cual un conjunto de células se aglomeran para cubrir y eliminar grandes estructuras representadas principalmente por organismo entomopatógenos como hongos, bacterias, protozoarios, nematodos y parasitoides (Chapman, 1998). De esta forma cuando un organismo invasor como cualquiera de los citados es demasiado grande para ser fagocitado, y es encapsulado por múltiples capas de hemócitos y/o capas de melanina. Por ello se han definido dos tipos de encapsulamiento en insectos: a) encapsulamiento celular, que es de común ocurrencia en lepidóptera y ocurre sin melanización; b) encapsulamiento melanótico, de común ocurrencia en díptera y puede ocurrir con la presencia o no de hemócitos, pero esta siempre asociado con la actividad de fenoloxidasas y al proceso de melanización (Gillespie et al., 1997). En general hemócitos granulares (granulócitos o coagulócitos) se depositan en la superficie del cuerpo extraño, liberando componentes quimiotáctiles que atraen plasmatócitos los cuales forman una pared multicelular con varias células de espesura. Las capas internas de la cápsula va aumentando de espesura, tornándose oscura debido a la producción de melanina (melanización) y finalmente ocurre una deposición de los plamatócitos sobre esa estructura que inviabiliza o anula a la partícula extraña llevándola incluso hasta la muerte, ocurriendo este proceso en un tiempo aproximado de 24 horas (Gillespie et al., 1997; Omoto y Alves, 1998).

La naturaleza de la encapsulación es dirigida ocurre normalmente como una medida de defensa contra protozoarios, metazoarios parásitos, nematodos y parasitoides (Gillespie et al., 1997). En especial para los grandes invasores, como larvas de parasitoides o nematodos entomopatogénicos, se evoca un tercer tipo de respuesta. Ellos son encapsulados por un gran número de hemócitos. Granulócitos descargan sus volúmenes en la superficie sobre estos invasores, proceso puede ocurrir dentro de los primeros cinco minutos después de la invasión. Aproximadamente 30 minutos después, son atraídos los plasmatócitos, donde comienzan estos a aumentar. Más plasmatocitos se adhieren al exterior del grupo que inicialmente actuó, con el objetivo de formar una cápsula que comprende varias capas de tejido celular que rodean y comprimen al patógeno.

El número de capas celulares varía con la especie de insecto y la naturaleza física y química de la superficie del objeto "microorganismo" encapsulado. La formación de nuevos hemócitos normalmente se completa dentro de 24 horas. Las células adyacentes al objeto se vuelven necróticas. La melanina producida a menudo en esta capa es resultado de la activación del sistema profenoloxidasa. Células dispuestas en las capas adyacentes se aplanan y presentan uniones intercelulares, uniones principalmente firmes y desmosomas se desarrollan entre ellos. La parte exterior de las células son menos modificadas (Chapman, 1998).

La encapsulación normalmente ocurre si el parásito está en un hospedero que no es usualmente parasitado aunque los medios en que ocurre este proceso aun no están especificados. En Insectos la encapsulación es un proceso de tipo celular, mientras que en Moluscos está formado principalmente por fibras.

Finalmente es de resaltar, que el proceso encapsulatorio ocurre en dos fases diferentes. (1) Los hemócitos (granulócitos y/o coagulócitos) se agregan alrededor de una partícula extraña. (2) los hemócitos portan substancias a la hemolinfa atrayendo a otros hemócitos (principalmente plasmatócitos) que facilitan y completan la formación de la cápsula. Los procesos de reconocimiento y no de las partículas extrañas, como en este caso de fagocitosis, pueden estar involucrados en procesos de encapsulación.

Parasitoides ocasionales que no son encapsulados en un insecto, comienzan a ser encapsulados, cuando empiezan presentan cambios en su superficie del insecto. Reconocimiento superficial es involucrado en la encapsulación de hongos como Entomophtrora ingresa por hemócitos de insectos (Dunphy y Nolan 1980). Así mismo granulócitos tienen la capacidad de encapsular hifas de hongos, mas no se adhieren a los cuerpos esféricos o cuerpos hifales germinales (protoplastos), los cuales poseen en su superficie proteínas que los protegen del ataque de los hemócitos.

Para el caso de las hifas, la quitina y las subunidades presentes en su pared, inician la encapsulación. Por otra parte, la activación de los hemócitos para que entren a formar parte de procesos de encapsulación de partículas extrañas, no se han establecido existiendo dos teorías: La primera propuesta por Salt (1970) citado por Tanada y Kaya (1993), señala que la respuesta celular es iniciada por contactos fortuitos de hemócitos de un hospedante con el parasitoide invasor, el cual es atraído desde una región distante. La segunda teoría desarrollada por Nappi (1975) citado por Tanada y Kaya, (1993) habla de la célula mediante reacciones inmunológicas son activadas por cambios en la concentración normal de hormonas del hospedero cuando el insecto es invadido por un parasitoide.

El no balance hormonal ocasiona cambios en la permeabilidad de la membrana celular y produce una prematura diferenciación de los diferentes tipos de hemócitos y su posterior migración. La alteración en la permeabilidad de estas células ocasiona destrucción de los hemócitos en la superficie del parasitoide y la transformación de sustancias que facilitan la encapsulación.

• Inhibición en la formación de la cápsula: Compuestos extraños muchas veces no pueden ser encapsulados. Tal es el caso de algunas toxinas producidas por algunos hongos que son capaces de inhibir procesos de encapsulación. Micotoxinas destrucxinas E1, incrementan la susceptibilidad en G. mellonella a Aspergillus niger a través de efecto de inmunodepresión sobre la encapsulación. Destruxinas A y B no presentan ningún efecto sobre la estructura del hongo (Tanada y Kaya, 1993).
• Melanización:En los Insectos se produce un acumulo de melanina en torno al parásito invasor que puede llegar a producir la muerte del mismo, especialmente cuando son Helmintos o artrópodos. La velocidad de melanización varía dependiendo del tipo de parásito (Tanada y Kaya, 1993).
• Coagulación:Estos fenómenos ocurren en grados variables en diferentes insectos y sirve para evitar el extravasamiento de la hemolinfa y la penetración del patógeno a través de heridas o cortes en le tegumento de los insectos. Inicialmente ocurre una cogulación, por coagulócitos y granulócitos y posteriormente entran en el proceso los plamatócitos, que participan en la formación de la nueva cuticula, en un proceso denominado cicatrización (Omoto y Alves, 1998).

3.2 DEFENSA HUMORAL

En el plasma (porción líquida, no celular de la hemolinfa con altos niveles de iones inorgánicos, de aminoácidos libres) ocurren las respuestas humorales de inmunidad, y algunos de los factores que la determinan son secretados por hemócitos particulares. Así mismo se cree que las respuestas humorales están íntimamente relacionadas con las respuestas celulares.

Específicamente la respuesta humoral es una reacción de defensa no celular y corresponde a la producción de anticuerpos, término algo controvertido al relacionarlos con insectos por algunos autores y otros relacionan directamente la respuesta humoral como un complemento de la defensa celular.

Como ejemplos clásicos de defensa humoral, en la hemolinfa de la pupa de Hyalophora normalmente contiene una proteína pequeña (48 kDa) conocida como la hemolina. En Manituca, su síntesis es inducida por la infección bacteriana. Esta hace parte de la familia de la immunoglobulina, proteínas que son importante en los sistemas inmunológicos de los vertebrados.

Peptidoglicanos producen un aumento en la cantidad de hemolina y comienza la síntesis de una colección de proteínas: un total de 15 proteínas diferentes en Hyalophora y 25 en larvas de Manduca. Esto incluye a dos familias mayores de proteínas conocidas como las cecropinas y las atacinas.

Las proteínas a menudo pertenecen a familias diferentes, de acuerdo a lo encontrado en varios insectos (Chapman, 1998).

Además de estas proteínas, los lysozimas son también inducido a aparecer por infección manifestada en la hemolinfa. Estas enzimas se han encontrado en gran variedad de insectos, incluso Lucusta y en grillos. Ellos parecen complementar la acción de las cecropinas en la digestión de paredes celulares que permanecen después del ataque por otras proteínas.

En Díptera, un proceso análogo al de encapsulación ocurre, pero al parecer sin involucrar la acción de los hemócitos. Este proceso es conocido como encapsulación humoral. Sólo se conoce que pueda ocurrir en Chironomidae y en otro Díptero pequeño cantidades de menos de 6000 ml del hemocytes m -1 por célula. Quizás los mecanismos celulares normales son ineficaces cuando la cantidad celular de estos es baja. Unos 2-15 minutos después de que una partícula extraña entra en la hemolinfa, los filamentos del material empiezan a rodear a la partícula. Pero el material se agrega hasta la partícula invasora es completamente rodeada por una cápsula de una a más micras de espesor. La cápsula sé melaniza, pero algunas descripciones sugieren que la proteína de la cápsula pueda alterarse de alguna manera análoga a la esclerotización de la cuticula.

Tirosina de la hemolinfa participa en este proceso. La encapsulación humoral parece ser un medio muy eficaz de encapsulación de patógenos, y como en el caso de la larva de Chironomusus puede resistir la inyección de dosis relativamente altas de bacterias patogénicas. Las bacterias, hongos y nematodos entomopatogénicos pueden ser encapsulados por este mecanismo (Boman y Hultmark, 1987; Gotz y Vey, 1986 citados por Chapman 1998)

Sin embargo se ha determinado, que algunas especies de nematodos entomopatogénicos, inhiben la respuesta humoral.

De acuerdo con Sambeek y Wiesner (1999) una vez los nematodos entomopatogénicos se encuentran en el hemocele y liberan sus bacterias simbióticas, se anula la defensa humoral, sin importar la colonización por la septicemia bacteriana.

Dentro de los principales factores de defensa humoral son clasificados en preexistentes o innatos y adquiridos o inducidos (Omoto y Alves, 1998).

3.2.1 INMUNIDAD INNATA

Aparentemente los insectos no poseen una respuesta inmune adquirida, basada en inmunoglobulinas o complejos anfígenos de histocompatibilidad como sucede en los vertebrados (Strand y Pech, 1995), sin embargo otros autores afirman que en la porción no celular de la hemolinfa (plasma) se pueden desenvolver factores de inmunidad natural. Esos factores pueden ser comparables con los anticuerpos (inmunoglobulinas y antígenos) desenvolvidos en los vertebrados (Tanada y Kaya 1993). Existen dos tipos de inmunidad innatos cuales son fenoloxidasas y hemaglutininas (lectinas). En cuanto a la enzima fenoloxidasa, considerada de importancia primaria en los procesos de encapsulación. Las hemaglutininas conocidas como lectinas se presentan con ocurrencia en lepidópteros y difieren en sus propiedades en otros órdenes de insectos su función es facilitar los procesos de fagocitosis, sin embargo su función aún no ha sido totalmente determinada, sin embargo en su función inmunológica pueden actuar por tres caminos: (1) como una membrana receptora, (2) como factores opsonicos humorales, (3) actuando independientemente de los hemócitos y aglutinando las bacterias invasoras (Lacke, 1981 citado por Tanada y Kaya 1993).

También proteínas y polifenoles pueden ser depositados en la superficie de los patógenos presentes en la hemolinfa, presentándose una mayor proliferación de los mismos. Aquí es necesario que exista un contacto directo con las células responsables de la detención o destrucción del parásito. Forman la primera línea defensiva y están presentes en la superficie corporal y en muchos invertebrados constituyen la única barrera defensiva (Chapman, 1998.

• Encapsulación humoral:En algunos dípteros, el plasma de la hemolinfa se encarga de melanizar y encapsular los microorganismos invasores (nematodos, hongos y bacterias) y los hemócitos no pueden estar necesariamente involucrados en la formación de la cápsula (Poinar, 1974 citado por Tanada y Kaya, 1993). Las cápsulas no celulares son llamadas cápsulas humorales y son formadas para contrarrestar la invasión de parásitos vivos.

Este inusual tipo de encapsulación ocurre de una forma rápida (las cápsulas son formadas en tan solo unos minutos), proceso altamente eficiente. Este proceso solo ocurre en insectos con un bajo número de hemócitos (Gotz y Boman, 1985 citados por Tanada y Kaya, 1993). Esta encapsulación vía plasma indica que el sistema tirosina-fenoloxidasa es de importancia primaria en la encapsulación. Inhibidores de la fenoloxidasa retardan la melanización o inhiben o retardan la formación de la cápsula (Gotz y Boman, 1985).

• Otros factores humorales:Algunos trabajos han detectado factores bactericidas de composición desconocida. Stephens (1963) reportado por Tanada y Kaya, (1993) encontró que después de colectar algunos insectos de campo, se encontró una alta actividad bactericida en la hemolinfa contra las bacterias Shigella dysenteriae y Salmonella typhosa. Ambas bacterias no son patogénicas a insectos, pero para el caso de las bacterias entomopatogénicas Pseudomonas aeruginosa y Bacillus cereus algunas especies de insectos testadas, presentan alguna reacción bactericida a estas bacterias.