Características histoquímicas, morfométricas y metabólicas del músculo Gluteus medius de equinosentrenados para competencias de salto (página 2)

La capacidad oxidativa es importante para los músculos esqueléticos por su influencia en la respuesta metabólica al ejercicio. El caballo tiene una alta capacidad oxidativa si se compara con otros animales y el hombre (Essén-Gustavsson y Lindholm, 1985). La evaluación de la capacidad oxidativa puede realizarse a través de las tinciones histoquímicas con nicotinamida tetrazolium reductasa (NADH-TR) (Lindhom y Piehl, 1984; Hodgson y col., 1985) y con succinato deshidrogenasa (Snow, 1983) o a través de la determinación de algunas actividades enzimáticas en el músculo completo, tales como la citrato sintetasa (CS), succinato deshidrogenasa (SDH) (Guy y Snow, 1977) y 3-OH-acil Co A deshidrogenasa (HAD) (Essén-Gustavsson y col., 1980) Estas actividades enzimáticas aumentan por efecto del entrenamiento y la profundidad de la biopsia (López, J. F., 1995; Islas y col., 1997).

El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de un programa de adiestramiento sobre la composición fibrilar, diámetro menor, área y capacidad metabólica del músculo Gluteus medius en equinos debutantes para competencias de salto. Los resultados se comparan con los valores obtenidos en el grupo previo al entrenamiento.

3. Material y metodos

En el estudio se emplearon 10 equinos mestizos adiestrados durante 6 meses para participar en competencias de salto para categorías debutantes (7 yeguas y 3 machos castrados), 50% fina sangre inglés de carrera (FSI) y 50% Hackney, categoría debutantes, clínicamente sanos, de 4 – 5 años de edad, pertenecientes a la Escuela de Equitación "Oscar Cristi Gallo" de Carabineros de Chile (Santiago). Los caballos habían realizado durante 6 meses un programa específico de entrenamiento para competencias de salto según la pauta de la Escuela de Equitación (Vigil, 1996), que tiene por objetivo desarrollar habilidades, destrezas de salto y capacidad física de los equinos. Se adjunta resumen del programa de entrenamiento. (Anexo 1).

Biopsias musculares. De cada caballo se obtuvieron 2 biopsias musculares a 3 y 6 cm de profundidad a través de la misma incisión. Las biopsias fueron tomadas con una aguja percutánea de 6 mm de diámetro interno (Henckel, 1983) de acuerdo al procedimiento descrito por Mora y col. (1995) y por Islas y col. (1997).

Una vez obtenidas las muestras, una parte fue inmediatamente congelada en nitrógeno líquido para realizar los análisis bioquímicos, mientras que aquellas para análisis histoquímico fueron colocadas sobre placas de poliestireno, bañadas en OCT para congelación de tejidos (Tissue Tek, Miles Sci., USA) y luego sumergidas durante 30 segundos en Isopentano (2-metilbutano Lab. Merck) enfriado previamente en nitrógeno líquido (Dubowitz, 1985). Las biopsias fueron almacenadas en un termo de nitrógeno a una temperatura de -196°C hasta su posterior procesamiento. Para disminuir la alteración que sufre el tamaño fibrilar debido a la contracción que experimentan las muestras obtenidas con aguja de biopsia, se dejó transcurrir 2 a 3 minutos desde la obtención hasta su congelación (López-Rivero y col., 1993a).

Métodos histoquímicos. De cada muestra se obtuvieron cortes seriados en un criostato (Microm HM 500) a -20°C, de 10 mm de grosor que fueron incubados para demostrar la actividad mATPasa (E:C:3.6.1.3.) a pH 9.4 tras preincubación ácida. La capacidad oxidativa de las fibras se evaluó en cortes seriados teñidos mediante NADH-TR (E.C. 1.6.99.3), para cada profundidad de biopsia (Dubowitz, 1985).

Según los patrones de tinción de mATPasa las fibras fueron clasificadas como tipo I (contracción lenta) o tipo IIA y tipo IIB (contracción rápida) (Brooke y Kaiser, 1970). Las fibras tipo IIB de acuerdo a la intensidad de la tinción con NADH-TR se clasificaron en oxidativas y no oxidativas.

Composición fibrilar. Se determinó la proporción de cada tipo de fibra muscular del tejido obtenido a las dos profundidades de las biopsias. Un área representativa de cada biopsia conteniendo al menos 200 fibras fue examinada sistemáticamente en las microfotografías en blanco y negro (x100) de los cortes teñidos con mATPasa.

Para obtener los porcentajes y tamaño fibrilar se examinó un área representativa de cada biopsia y se determinaron las frecuencias relativas de las fibras tipos I, IIA y IIB. Los tipos IIB oxidativas y IIB no oxidativas fueron calculadas sobre las microfotografías en blanco y negro (X100) en los cortes teñidos con NADH-TR, mediante el cómputo de 200 fibras /biopsia.

Morfometría. El área transversal y el diámetro mínimo de los tipos de fibras se obtuvo sobre microfotografías procesadas con un sistema de imagen en un programa morfométrico computacional (Imago, Grupo SIBA, Universidad de Córdoba España). Sólo se midieron las fibras de las biopsias con bordes celulares nítidos y localizadas en la zona central. De cada muestra se midió un mínimo de 25 fibras de cada tipo, obteniéndose el área y diámetro mínimo (Dubowitz, 1985).

Análisis bioquímico. 50 mg de tejido muscular libre de tejido conectivo y adiposo fue lavado en tampón fosfato (PBS) pH 7,3 en frío, centrifugado tres veces a 1000 g por 10 minutos en una centrífuga Sorvall R-C-5B para eliminar la sangre. El sedimento obtenido se solubilizó en 5 ml de PBS, y se homogenizó en un triturador ultra turrax T-25 a 8000 rpm, posteriormente se sometió a un sonicador Trassonic C-460 por 30 segundos y luego se centrifugó a 7000g durante una hora a 4C. En el sobrenadante se determinaron las enzimas deshidrogenasa láctica (LDH) (EC 1.1.1.28), creatinquinasa (CK) (EC 2.7.3.2.), citrato sintetasa (CS) (EC 4.1.3.7.) y 3- OH-acil-CoA dehidrogenasa (HAD).

Las actividades de las enzimas CK y LDH se determinaron midiendo la variación de absorvancia a 365 nm de NADPH y NADH por minuto, respectivamente, utilizando reactivos comerciales (Laboratorio Boehringer, Mannheim, kits N 1087592 y N 1087533). La actividad CS se detectó según el método descrito por Alp y col., (1976) y la HAD por el método de Kline y Bechtel (1987).

Las proteínas se determinaron por el método de Lowry y col. (1951), usando seroalbúmina de bovino como estándar. Todas las determinaciones espectrofotométricas se realizaron en un equipo Shimadzu UV-120-02 a 25C.

Análisis estadístico. Los resultados se expresaron en porcentaje y se aplicaron pruebas estadísticas convencionales para obtener la media y desviación estándar de cada variable. Las diferencias entre las profundidades de muestreo fueron valoradas por medio de una prueba "t" de Student para observaciones pareadas y un análisis de varianza.

Los resultados se compararon con los valores obtenidos en el mismo grupo, previo al entrenamiento, a través de un análisis de varianza, considerándose la edad, entrenamiento y profundidad de la biopsia sobre la composición fibrilar y actividad de las enzimas evaluadoras del metabolismo muscular.

4. Resultados

El estudio histoquímico realizado permitió determinar la composición fibrilar del músculo Gluteus medius de los equinos de salto debutantes.

Los tipos de fibras observadas en función de la profundidad pre y post-entrenamiento se presentan en el cuadro 1.

Se observa que los porcentajes de fibras tipo IIA no tienen variación ni en la profundidad ni en relación al entrenamiento. El porcentaje de fibras tipo I varió significativamente en profundidad, pero no en relación al entrenamiento. El porcentaje de fibras tipo IIB varió significativamente tanto en relación a la profundidad como al entrenamiento. El porcentaje de fibras tipo IIB oxidativas varió en relación al entrenamiento, pero no a la profundidad, y el porcentaje de fibras tipo IIB no oxidativas no varió en relación a la profundidad en el pre-entrenamiento pero sí en el entrenamiento (cuadro 1).

CUADRO 1. Tipos de fibra presentados como porcentajes (%) en el músculo Gluteus medius de equinos pre-entrenamiento y post-entrenamiento (promedios y desviación estándar).

Fibre types presented as percentage (%) in Gluteus medius muscle of horses before training and after training (mean and standard deviation).

El análisis morfométrico de las fibras determinó que las áreas y el diámetro de las fibras tipo I, IIA y IIB no presentan diferencias significativas por efecto de la profundidad y el entrenamiento, existiendo diferencias significativas para las áreas entre las fibras tipo I con IIB y IIA con IIB, previo al entrenamiento y posterior a él. Presentando el diámetro diferencias significativas entre las fibras tipo I, IIA y IIB.

El estudio de la actividad de las enzimas citrato sintetasa, 3-OH acil coA deshidrogenasa, deshidrogenasa láctica y creatin fosfoquinasa determinó diferencias significativas en la actividad de las enzimas CS y HAD por efecto de la profundidad y el entrenamiento.

La enzima LDH no presentó diferencias significativas por efecto de la profundidad y el entrenamiento. La enzima CK no presenta diferencias significativas por efecto de la profundidad de la muestra, observándose una disminución de ella por efecto de entrenamiento.

El analisis de varianza determinó que no se producen variaciones en los parámetros estudiados por efecto de la edad, observándose variaciones significativas en la actividad de las enzimas evaluadoras del metabolismo oxidativo por efecto del entrenamiento y la profundidad de la biopsia y en el porcentaje de las fibras tipo IIB oxidativas por efecto del entrenamiento.

CUADRO 2. Areas (µm2) y diámetro menor (µm) de las fibras del músculo Gluteus medius en equinos pre-entrenamiento (Islas y col., 1998) y post-entrenamiento (promedio y desviación estándar).

Area mm2 and lesser diameter (µm2) of Gluteus medius muscle fibre in horse before and after training (mean and standar deviation).

5. Discusion

En este estudio se observaron cambios en la composición fibrilar relacionada con la profundidad de la biopsia. Se obtuvo un aumento significativo de las fibras tipo I y una disminución de las fibras tipo IIB a mayor profundidad del tejido. El patrón de variación de las características fibrilares según la profundidad de la biopsia observada en este estudio es similar a los resultados obtenidos en otras investigaciones (Kline y col., 1987; López-Rivero y col., 1992; Islas y col., 1996), lo que muestra la importancia de realizar dos o tres biopsias en el mismo sitio a diferentes profundidades para tener una mejor representación de la composición fibrilar del músculo Gluteus medius. El porcentaje de fibras tipo I para los caballos de salto en adiestramiento es similar a los standardbred y fina sangre de carrera sin entrenamiento (Henckel, 1983; López-Rivero y col., 1993, 1993a). El porcentaje de fibras tipo IIA se mantiene sin variación a las dos profundidades, siendo menor a lo observado en otras razas después de un período de entrenamiento (Henckel, 1983; López-Rivero y col., 1989, 1990). El porcentaje de fibras tipo IIB oxidativas y no oxidativas disminuyó en forma significativa con la profundidad de la biopsia, lo que difiere de estudios realizados en standarbred, andaluz y thoroughbred (Andrews y Spurgeon, 1986; Essén-Gustavsson y Lindholm, 1985; López-Rivero y col., 1993a) y concuerda con los valores obtenidos en caballos de tiro en los cuales a mayor profundidad de la biopsia aumenta el porcentaje de fibras posturales y ocurre un descenso de las fibras de contracción rápida (Islas y col., 1996 y 1997). Al comparar la composición fibrilar de estos caballos en adiestramiento con los valores obtenidos previamente en reposo (Islas y col., 1998) (cuadro 1) se observa un aumento de las fibras tipos IIB oxidativas (p<0,05), lo que se debería al efecto del adiestramiento, lo que concuerda con los resultados obtenidos al estudiar la capacidad metabólica en estos mismos caballos, los cuales presentan un aumento significativo del metabolismo oxidativo de las fibras (p<0,05) (cuadro 3). Es conocido que la composición fibrilar tiene un componente genético importante a considerar y por lo tanto las características fibrilares de este grupo de caballos es diferente a otras razas estudiadas debido a que son una mezcla de fina sangre de carrera y Hackney (50%)

CUADRO 3. Actividad de las enzimas citrato sintetasa (CS), 3 OH ACIL Co A deshidrogenasa (HAD), deshidrogenasa láctica (LDH) y creatin fosfoquinasa (CK) (U/mg proteína) en músculo Gluteus medius de equinos antes del entrenamiento y después del entrenamiento (promedio y desviación estándar).

Activity of citrate syntase (CS), 3 OH ACYL Co A dehidrogenase (HAD), lactic dehidrogenase (LDH) and creatine inase (CK) (U/mg protein) in Gluteus medius muscle in horses before training and after training (meand and standard desviation).

Estudios anteriores realizados en músculo Gluteus medius de equinos standardbred han demostrado un aumento de las fibras tipo I y un incremento significativo en la proporción de fibras tipo IIA en relación a las tipo IIB por efecto de la edad y el entrenamiento (Essén-Gustavsson y col., 1980; Henkel, 1983).

Al comparar los resultados de esta investigación con un estudio preliminar realizado en estos equinos, previo al programa de adiestramiento (Islas y col., 1998), se observó un aumento de las fibras tipo IIB oxidativas, lo que indica que el adiestramiento produce cambios en las características fibrilares del grupo en estudio, observándose un mayor desarrollo muscular que se corrobora por el aumento del tamaño de las fibras tipo IIB y concuerda con los estudios que han demostrado que el entrenamiento en esta especie produce una hipertrofia de las fibras musculares (Serrano y López-Rivero, 1996), no observándose efecto de la edad sobre la composición fibrilar (p>0,05).

El área y diámetro de las fibras son similares a los obtenidos por otras razas (Essén-Gustavsson y Lindholm, 1985; López-Rivero y col., 1993a; Ronéus, 1992). Las fibras de menor tamaño y diámetro tienen un mejor abastecimiento de capilares, lo que permite una mejor irrigación y más difusión de oxígeno y sustratos a la célula y al mismo tiempo realizan una mejor eliminación de los productos del metabolismo de ellas (Essén-Gustavsson y col., 1989).

Asociado a los cambios en la composición fibrilar, estudios realizados por Ronéus y col. (1992) demuestran que el ejercicio produce cambios metabólicos en la fibra muscular. En este estudio, se observó un aumento de las actividades enzimáticas del metabolismo oxidativo por efecto del entrenamiento (p<0,05), lo que muestra que el músculo Gluteus medius es muy activo y adaptable al ejercicio y concuerda con trabajos anteriores que han demostrado que una adaptación muscular al ejercicio se traduce en un aumento de la capacidad oxidativa de las fibras (Valberg y col., 1998; Hodgson y col., 1985).

Las actividades de CS y HAD aumentaron en 70% y 80% respectivamente, después de un período de adiestramiento de seis meses, comparados con los valores obtenidos en estos mismos equinos en reposo (cuadro 3). Resultados similares han sido obtenidos por otros autores en otras razas (Snow y Guy, 1981; Hodgson y col., 1985), lográndose un mayor aumento de las actividades de estas enzimas cuando los equinos son sometidos a un adiestramiento intenso (Essén -Gustavsson y col., 1989). Estos resultados indican que los caballos estaban realizando un trabajo principalmente aeróbico, utilizando la energía obtenida de la oxidación mitocondrial de la glucosa y de los ácidos grasos.

Las actividades de LDH y CK no aumentaron por efecto del adiestramiento, al comparar estos resultados con los obtenidos previos al entrenamiento (cuadro 3), lo que indicaría que el metabolismo anaeróbico de los carbohidratos no es una fuente importante de energía para estos animales durante el adiestramiento. Es probable que tanto la oxidación del piruvato obtenido por la vía glicolítica como la de los ácidos grasos sea más eficiente durante el adiestramiento, lo que explicaría la disminución de LDH, estos resultados son concordantes con los obtenidos por Hodgson y col. (1985) en caballos sometidos a ejercicio en "treadmill".

Los resultados obtenidos en esta investigación indican que el músculo Gluteus medius de estos equinos presentan cambios en sus características fibrilares y actividad metabólica, como causa del adiestramiento.

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A. Islas1, MV, MS; M. Quezada1, MV, Dr.Met.Vet; A. Bernales2, MV; G. Mora1, MV, MS ; J.L. López-Rivero3, MV, Dr. Med. Vet.; V. Merino1, BQ, MS; P. Dossow, MV; V. Rojas, MV; L. Marín1, TM. – Reproducción autorizada por: Revista Archivos de Medicina Veterinaria,

1 Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Concepción, Casilla 537, Chillán, Chile. 2 Escuela de Equitación de Carabineros "Oscar Cristi Gallo", Santiago, Chile. 3 Facultad de Veterinaria, Universidad de Córdoba, España. Publicación original: Arch. med. vet., 2000, vol.32, no.1, p.11-19. ISSN 0301-732X.