Fig: Patrón típico de acumulación lipídica para una levadura (Rhodotorula glutinispR. gracilis), crecimiento con un medio con alta razón de C:N ; todo esto en cultivo batch
( cuadrado negro: biomasa; Cuadrado blanco: contenido porcentual de lípido; círculo: NH4+ presente en el medio )
(de YOON et al., 1982).
Se aprecia que a medida que medida que disminuye la concentración de nitrógeno, se produce una marcada acumulación de lípidos en el cultivo ( 24 – 48 hrs ). Las células sólo empiezan a transformar el sustrato en grasas de reserva sólo cuando la reserva de nitrógeno en el medio se ha agotado y han terminado por lo tanto la síntesis de proteína y por lo tanto el crecimiento. En el caso de las levaduras, la asparigina y el ácido aspártico son especialmente apropiados como fuente de nitrógeno para producir una alta producción de grasas
La acumulación de lípidos también ha sido examinada en un cultivo continuo de 1 etapa y el perfil de acumulación depende también de la razón de dilución, razón de crecimiento mostrada en la figura. Al igual que en el cultivo batch el medio tiene que estar formulado con una alta razón de carbono: nitrógeno, la que debe ser de 50 : 1 o mayor. El cultivo debe tener una razón de crecimiento absoluto de mas menos un 25 a 30 % de el máximo. Bajo estas condiciones la concentración de nitrógeno en el medio es virtualmente nula y entonces el organismo tiene suficiente tiempo de residencia dentro del quimiostato para asimilar el exceso de carbono y convertirlo en lípidos.
La razón de producción de lípidos ( gramos / Litro-1 * hora-1 ) es usualmente más rápida en cultivos continuos que en batch’s únicos.
Fig: Patrón típico de acumulación para levadura (Rhodotorula glutinis) ,creciendo en un medio limitante de nitrógeno, en cultivo continuo
( cuadrado negro: biomasa; Círculo: contenido porcentual % de lípidos )
La razón exacta de carbono y nitrógeno fue elegida para que el nitrógeno limitante y el exceso de carbono fuera metabolizado en forma de lípidos.
Aunque el más alto contenido de lípidos de la célula 50 % peso/peso fue obtenido con una razón de 50: 1 o superior, la razón óptima para la máxima productividad (gr L-1 h-1 lípidos )fue con la tasa de 25 : 1 con glucosa y de 30 – 35 : 1 cuando fue usado permeado de suero como sustrato con la misma levadura.
Similares resultados para describir la razón óptima de C:N , para obtener la mejor acumulación de lípidos , fueron investigados con Rhodotorula glutinis.
Otra característica importante es la acumulación de carbohidratos en un 20 %, en células con un 50 % de lípidos, asumibles como una condición de espera para la pronta transformación en grasas.
Otro sistema de cultivo: el cultivo por lote alimentado ha proveído a los experimentadores de una forma de incrementar la densidad celular junto con el contenido lipídico en las levaduras. Es así como Yamauchi ( 1983) uso etanol como sustrato para la Lypomyces starkeyi y consiguió una densidad de biomasa de 150g L-1 con un contenido de lípidos de 54 %; Rhee ( 1986 ) alcanzó 185 gramos en base seca de Rhodotorula glutinis por litro con un contenido de lípidos de 43 % usando glucosa como sustrato de alimentación. En este último caso se utilizó aire enriquecido ( 40 % de O2 + 60% de aire) para ser suministrado a las células. Con la densidad anterior un 75 % del volumen total correspondió a las células . En caso de no usar el " O2 enriquecido " la densidad de células es alcanzada con mas variedades de levaduras oleaginosas, aunque existe la contaminación por mohos filamentosos.
Lamentablemente los costos del aire enriquecido, imposibilitarían la implementación comercial; aunque hay que dejar en claro que las más altas tasas de formación de lípidos ocurren en cultivo por lote alimentado, que en los sistemas batch o de cultivo continuo.
Las grasas se extraen en éter de petróleo de la masa celular que ha sido previamente deshidratada y precipitada con etanol o metanol.
De la especie Endomyces Vernalis se extrajeron también pastas untables ricas en proteínas, grasas y vitaminas, en las que la levadura formaba una gruesa capa rica en grasas, que podían ser procesadas directamente si el cultivo se realizaba en un recipiente plano( procedimiento en superficie o en "sartén " )
En cuanto a los mohos ,estudios realizados por A.Azeem; Neelagund y Rathod , indican una presencia importantes de ácidos grasos poliinsaturados que pueden ser acumulados en distintas especies como : Aspergillus nidulans, Aspergillus sydowii, Fusarium equisetti, Fusarium oxysporum.
Para comprobar esto se realizó un estudio utilizando un modificación al medio Czapek – Dox , de modo de maximizar la producción para dichos mohos
Mohos | Fuente de Carbono | Nitrógeno | Fuente de Sales minerales | |||||
Sacarosa % | NH4NO3 | NaH2PO4. 2H2O | MgSO4. 7H2O | K2SO4. 6H2O | FeCl3. 7H2O | ZnSO4. 7H2O | pH | |
A. nidulans | 30 | 0.30 | 0.730 | 0.50 | 0.022 | 0.016 | 0.005 | 6.8 |
A. sydowi | 20 | 0.30 | 0.730 | 0.50 | 0.022 | 0.016 | 0.005 | 6.8 |
F.oxysporum | 20 | 0.45 | 1.098 | 0.50 | 0.044 | 0.016 | 0.005 | 6.8 |
Urea | ||||||||
F. equisetti | 30 | 0.225 | 0.730 | 0.50 | 0.022 | 0.016 | 0.005 | 6.8 |
- Concentración usada para 100 ml de medio
Los esteres de metil que identifican a los distintos ácidos grasos, fueron identificados a través de técnicas cromatográficas
Los datos obtenidos fueron analizados en base a la proporción ( porcentaje ) de ácidos grasos insaturados de los aceites microbianos, comparándolos con los de los otros aceites comestibles.
Microbiano | Cont | Composición ácidos grasos(%) | ||||||||||||||
Aceite(SCO) | Grasa | C8 | C9 | C10 | C11 | C12 | C13 | C14 | C16 | C18 | C20 | C22 | C16:1 | C18:1 | C18:2 | % de |
Fuente: | (% w/w) | |||||||||||||||
Moho | Ácidos grasos | |||||||||||||||
A. nidulans | 50.0 | 7.7 | 4.9 | 7.5 | – | 7.4 | – | 5.3 | 14.5 | – | – | – | – | 30.8 | – | 39.43 |
(Ri-1.473) | ||||||||||||||||
A. sydowii | 42.1 | 1.2 | 1.4 | 1.3 | 1.8 | 2.4 | 4.6 | 3.2 | 18.6 | – | – | – | – | 62.9 | – | 64.57 |
(Ri-1.474) | ||||||||||||||||
F. oxysporum | 51.0 | 0.5 | 0.3 | 0.5 | – | 1.75 | – | 7.6 | 29.5 | – | – | – | – | 52.4 | – | 56.61 |
(Ri-1.470) | ||||||||||||||||
F. equisetti | 36.2 | 0.7 | 0.5 | 0.4 | – | 1.7 | – | 0.6 | 34.0 | – | – | – | – | 46.0 | – | 54.82 |
(Ri-1.471) | ||||||||||||||||
Aceite de nuez | – | – | – | – | – | – | – | – | 12.6 | 1.7 | 4.2 | 2.1 | 1.4 | 47.9 | 29.9 | 79.35 |
Aceite dePalma | – | – | – | – | – | – | – | – | 42.0 | 4.3 | – | – | – | 37.9 | 9.0 | 50.32 |
Aceite de coco_ | – | 9.2 | – | 9.7 | – | 44.3 | – | 15.9 | 7.8 | 2.3 | – | – | – | 7.8 | 0.8 | 8.79 |
Los datos recogidos muestran un porcentaje interesante de lípidos, así como un porcentaje interesante de ácidos saturados como insaturados.
Así podemos decir que del F. Oxysporum el más alto porcentaje de ácidos grasos saturados se encuentran en en los ácidos miristicos y palmíticos (C14 , C16, respectivamente ); el A. Sydowii no sólo contiene todos los ácidos saturados que produce el moho anterior sino que produce cantidades importantes de ácidos C11 y C13, además en todos los microorganismos se presentó ácido oleico ( 18:1)
Además el perfil de ácidos grasos muestra que el % total en A. nidulans, A. sydowii, F. oxysporum y F.Equisetti es de 78.1 , 97.4, 92.55, 83.9 respectivamente. Además de estos respectivos totales el A.nidulans tiene un 60.5% de ácidos saturados y 39.43 % de insaturados que fue la única especie que obtuvo mayor cantidad de ácidos grasos saturados; mientras que las otras especies lograron una mayor % de ácidos grasos insaturados.
Con respecto al rendimiento de lípidos logrados la dependencia del medio de cultivo es notable, estudios anteriores en las mismas especies logran rendimientos de lípidos de 9.3 – 38.7 %.
Además el perfil de ácidos grasos obtenidos por el F. Oxysporum, es similar al aceite comestible de palma; y un cambio de medio a sacarosa sólo logra la interconversión entre las cantidades de C16 y C18 obtenidas, por lo que aparenta que la síntesis de cadenas largas de ácidos grasos es la misma.
Además basándonos en la presencia de ácido oleico, los aceites microbianos de A.sydowii y F.oxysporum son similares a los del aceite de nuez
Las microalgas son una fuente biológica de lípidos e hidrocarburos, contienen ácidos grasos en los componentes de sus membranas, en sus fuentes de reserva. Los ácidos grasos e hidrocarburos tienen un alto potencial de aplicaciones. Los aceites de las algas tienen composiciones similares a la de los demás aceites vegetales utilizados, y en el futuro podrían ser usados masivamente en alimentación. Los lípidos y ácidos grasos contenidos en las microalgas varían acuerdo a ciertas condiciones el cultivo, en algunos casos, el contenido lipídico puede ser incrementado por la imposición de un régimen austero de nitrógeno, suministrando sólo una pequeña parte de sales nutritivas nitrogenadas ( como máximo 1 % del medio de cultivo) u otros factores de stress celular. A comienzos de los años 40 los estudios revelaban que , las fracciones lipídicas llegaban a 75 – 80 % de su peso en base seca, lo que supera por mucho a gran cantidad de especies terrestres, por ejemplo el alga verde Chorella pyreneidosa y algunas diatomeas ( por ejemplo Nitzchia spp. ) pueden almacenar un máximo de 70 – 80 % y 42 % de su peso seco como grasa respectivamente
Deficiencias de otros nutrientes, además del nitrógeno, podrían ayudar al incremento del contenido lipídico celular, es así como la falta de silicon por un periodo de 14 horas logró un incremento del 60 % de lípidos .
El cambio de acumulación de carbohidratos a lípidos ocurre muy rápido en las diatomeas, por mecanismos que aún no están bien clarificados
Durante las primeras etapas decrecimiento de los cultivos de algas, estas producen un alto monto de lípidos polares y ácidos grasos poliinsaturados como C16 y C18 .
En la fase de crecimiento estacionario se presentan ácidos grasos 18:1 y 16:0. En el caso de las algas verde azuladas, la composición de lípidos y ácidos grasos, muestra sólo pequeños cambios durante el ciclo de crecimiento.
Pero no sólo la nutrición influyen en la composición lipídica, sino que otros factores como la luz incrementan la formación de poliinsaturados C16 y C18 , así como esfingolípidos y fosfogliceridos en Euglena gracils y Chlorella vulgaris respectivamente. Se ha visto además que las bajas temperaturas incrementan la síntesis de ácidos grasos polinsaturados C18 para Monocrysis lutheri y también causa cambios en la composición de Dunaliella salina
El contenido de glicerol es también influenciado por las condiciones del cultivo, particularmente las concentraciones de NaCl, en la figura se muestra la relación que existe entre la concentración de NaCl, el crecimiento de la célula y la acumulación de glicerol en Dunaliella tertiolecta. El mayor rendimiento de glicerol se obtuvo cuando la concentración de NaCl alcanzó los 2M, mientras que el máximo crecimiento ocurrió cuando se obtuvo la mas baja concentración de NaCl
Fig: Relación entre la concentración de NaCl y la concentración intra y extracelular de glicerol
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Sin embargo todas estas ventajas se ven entrampadas principalmente por 2 motivos, la necesidad de dosis ininterrumpidas de luz, así como los problemas organolépticos de los aceites obtenidos:
Por calentamiento con luz solar de un cultivo análogo , podrían obtenerse en seis meses con algas anteriormente nombradas, sobre una superficie de 500 m2, aproximadamente 100 kg de grasa. En cambio con un cultivo de colza se obtuvieron 24 – 50 kg . Pero debido a su sabor poco agradable no puede utilizarse la grasa bruta de las algas en la alimentación y por otra parte es muy costosa su purificación en comparación con la utilización directa de las grasas vegetales. Aunque su empleo sería posible en situaciones críticas de abastecimiento como ocurrió en la segunda guerra mundial.
El principal foco de los investigadores, debido a la necesidad de renovar las fuentes de energía fósiles y que sean lo menos contaminantes posibles es la de obtener biocombustibles.
Anexo: Cultivo a escala laboratorio de algas
La microalga verde Dunaliella tertiolecta ATCC 30929 fue cultivada en un medio con la siguiente composición: NaCl 58.5g; MgCl2•6H2O 1.5g; KNO3 1.0 g; MgSO4 •7H2O 0.5 g; KCl 0.2g; CaCl2 •2H2O 0.2 g; NaHCO3 43mg; KH2PO4, 40.8 mg; K2HPO4 0.495 g; FeCl3 solucion 1.0 ml; metalica solucion 1.0 ml. La FeCl3 solucion consistió en (por litro): FeCl3 0.03 g; EDTA •2Na 5.84 g. La metalica solucion consistió en (por litro): H3BO4 0.61 g; MnCl2 •4H2O 23mg; ZnSO4 •7H2O 87mg; CuSO4 •7H2O 0.06 g; (NH4)6Mo7O24 •4H2O 21mg; CoCl2 •5H2O 15mg; EDTA •2Na 1.89g. El cultivo maestro es depositado en 3 L de medio a 27°C, usando un fermentador de 5 litros (Fig. 6-3). La tasa de aireación y la rapidez de agitación fue mantenida constante a 1 vvm y 200 rpm, respectivamente. gas fue producido por mezcla de CO2 con aire a una razón fija entre 0 y 0.1 y lámparas fluorescentes son usadas para la irradiación externa del fermentador; el grado de irradiación que llega al recipiente del fermentador es de 10,000 1x.
Fig: Aparato fermentador de 5 Litros utilizado en el cultivo de microalgas
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Fig: Efecto de la intensidad de la luz en un fermentador de microalgas de 5L
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La figura muestra que el crecimiento celular se ve determinado por la intensidad de la luz, obteniéndose crecimiento de prácticamente el doble cuando la intensidad de la luz es el doble ( 100000 a 5000 lx )
Con respecto CO2, el crecimiento celular normales dentro el fermentador ocurre a concentraciones de 3 a 10 %, no obstante el crecimiento limitado ocurre a concentraciones muy bajas alrededor de 0.03 % de CO2
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Fig: Concentración celular con diferentes concentraciones de CO2
Anexo: Fotografías de microorganismos productores de lípidos
Fig:Chlorella pyreneidosa Fig:Endomyces vernalis Fig: Nitzchia spp
- Dentro de los microorganismos aquellos que tienen mayores oportunidades de desarrollo están principalmente los hongos en general ( mohos y levaduras ) y le siguen las algas, muy por detrás están las bacterias que acumulan una menor cantidad de lípidos
- Las algas a pesar de poder contener un porcentaje alto de su peso en lípidos, sufren el problema de ser dependientes de la luminosidad para lograr primero su crecimiento y luego la concentración de material lípidico en su interior, por lo que su cultivo si es a gran escala, debe ser en zonas de alta incidencia de luz solar, además cuentan con la desventaja de un sabor poco agradable, que requiere de procesos de refinación, que encarecerían el costo
- El mecanismo por el cual se producen la acumulación de lípidos es el mismo en bacterias y hongos: las celulas se ven enfrentadas a una falta de nitrogeno en su medio y/ o otros nutrientes, mientras la disponibilidad de carbohidratos supera sus requerimientos, de esta manera la celula ya no puede sintetizar proteinas y por lo tanto deja de multiplicarse; su metabolismo cambia y de producir reservas de energía del tipo carbohidrato pasa a crear material de reserva lipídico.
- La producción de lípidos y ácidos grasos por la biotecnología es una rama incipiente, que todavía necesita de modificaciones de modo de poder competir comercialmente con la producción obtenida de las especies vegetales.
- La producción de lípidos microbianos, de ser comercializada hoy día sólo puede ser un complemento de las distintas alternativas que hoy se presentan en el mercado, a través de su parecido ( por composición de ácidos grasos, porcentajes de estos dentro del material lipídico), a muchos aceites vegetales, ejemplo aceite de nuez, palma,etc.
- Jagnow C. Dawid D. (1991 ) ; Biotecnología, Introducción con experimentos modelo; Ed Acribia S.A ; p: 67 – 70
- Monckeberg. F (1988 ) ; La Revolución de la Bioingeniería; Publicaciones Técnicas Mediterráneo ; p: 63-67
- Abdul Azeem, Neelagund YF, Vandana Rathod (1993) Production of fat from fungi:Influence of temperature. Bull Pure & Appl Sci 128(1–2) p: 31–35.
- Rattan Chand, Srinivasan RA (1984) Lipid and phospholipid synthesis by Fusarium sps.N-9, Part III: Influence of temperature and pH on the production of fat in the cells of Fusarium sps. Indian J Dairy Sci 37(4)p: 389–392.
- Boletín Informativo FAO 2000; Oil Products
- Colin Ratledge; Microbial Lipids; p: 135-142
- A Azeem, Y.F. Neelagud_ and V. Rathod (1999);Biotechnological production of oil: Fatty acid composition of microbial oil Plant Foods for Human Nutrition 53: 381–386.
Datos del autor:
Sebastian Acuña Verrugio
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