Vitaminas Hidrosolubles (página 2)

Muchos de los métodos mencionados han sido adoptados, al menos en parte, en países con tecnología alimenticia altamente desarrollada. Sin embargo, no hay un enfoque uniforme y pocos países tienen una política de fortificación definida. (3)

Desde hace aproximadamente 50 años se han venido desarrollando programas de fortificación de alimentos en países en vías de desarrollo y se han logrado considerables progresos en la reducción de las deficiencias de los nutrientes.

Entre los criterios que han sido aplicados para proponer la fortificación de alimentos con objetivos de salud pública, se señalan los siguientes:

1. Necesidad demostrada de nutrientes en uno o mas grupos de la población.
2. Existencia de un alimento como vehículo para que los nutrientes lleguen hasta la población en riesgo.
3. Garantía de la ingestiones adecuadas del nutriente añadido al alimento, cuando se consume en cantidades normales por parte de la población en riesgo.
4. Equilibrio en la cantidad del nutriente añadido para evitar efectos nocivos al individuo que ingiera gran cantidad del alimento fortificado.
5. Utilidad biológica del nutriente bajo la forma añadida y estable en el alimento seleccionado como vehículo. (3,13)

Desde los años 70 se comenzaron a fortificar los alimentos en países de América Central, tales como Guatemala, Costa Rica, Honduras y El Salvador. Varios países han experimentado la fortificación de harinas de maíz y de trigo con hierro, tiamina, riboflavina y niacina y mas recientemente con ácido fólico y vitamina A. En el año 1998 se inició la fortificación con vitaminas en alimentos, particularmente en harinas, en el Sur de África, específicamente en Zambia y en la actualidad otros países africanos y asiáticos fortifican sus alimentos con vitaminas. (6)

La fortificación de cereales con hierro y vitaminas también se ha puesto en práctica en estos países para contrarrestar las deficiencias de estos nutrientes en las poblaciones más necesitadas. (6, 11)

• Aspectos Instrumentales de la Electroforesis Capilar:

Los equipos desarrollados por la industria instrumental recién aparecieron en 1988 y no fue hasta el año siguiente, donde se mostraron los extraordinarios avances de este novedoso método analítico. Los equipos de electroforesis capilar están conformados por dos compartimientos electroforéticos unidos por un capilar, conectados a su vez a una fuente de alta tensión de 20 a 30 Kv. Parte del capilar es sometido a la luz UV con un detector unido a un registrador, que grafica la absorbancia en función del tiempo de corrida y a un sistema de administración de datos (Figura 1).

Figura 1. Esquema de un equipo de electroforesis capilar.

Tomado de:

En la EC la solución amortiguadora usualmente se desplaza a través del capilar bajo la influencia de un campo eléctrico. Este fenómeno es llamado flujo electroosmótico o electroendosmótico (FEO). Las moléculas cargadas son separadas debido a las diferencias en sus movilidades electroforéticas y tienden a migrar hacia el electrodo que posea la carga opuesta a ellas. Cuando el tampón o solución amortiguadora es introducida dentro del capilar, la superficie interna del capilar adquiere carga, esto ocurre por la ionización de la superficie del capilar o por la adsorción de iones del tampón; la superficie de los capilares de sílica, posee grupos silanoles (Si – OH) que son ionizados a grupos cargados negativamente, grupos silanoatos (Si – O-) , a pH mayores a 3.

Las cargas positivas de los iones del tampón son atraídas por los grupos silanoatos formando una fina capa en la pared del capilar, como se muestra en la figura 2. Estos cationes no son suficientes para neutralizar todas las cargas negativas de la pared del capilar, por lo que se forma una segunda capa externa de cationes. La capa interna está más atraída a los grupos Si – O- y se denomina "capa fija". La otra capa de cationes no está tan fuertemente atraída por estos grupos, ya que se encuentra más alejada de ellos y se le denomina "capa móvil" . Estas dos capas conforman lo que se conoce como la "doble capa" de cationes. Cuando se aplica el campo eléctrico, la capa móvil se desplaza hacia el electrodo cargado negativamente. Una vez que estos cationes son solvatados arrastran a la mayor parte de la solución amortiguadora, causando el FEO. (1, 7, 9, 14)

Figura 2. Flujo Electroosmótico.

Una de las etapas básicas en la separación en EC es la elección de la solución amortiguadora, ya que la sensibilidad del FEO al pH requiere buffers que mantengan el pH constante. En esta técnica se pueden usar una amplia variedad de buffers desde pH 2.5 hasta 10, los más usados son el buffer fosfato pH 2.5 y 7 y el borato pH 9, en diferentes concentraciones, el impacto del pH en el analito pude producir complejos que facilitan su detección; también se pueden agregar, al buffer, ciertos aditivos que permiten acelerar la velocidad de la corrida o bien modificar la estructura interna del capilar para detectar compuestos aniónicos.

La electroforesis capilar es una excelente técnica cualitativa, tomando en cuenta los espectros de las especies de interés; o bien cuantitativa tomando en cuenta alturas y áreas de pico, ya que estas son proporcionales a la concentración. El análisis cuantitativo de las muestras se hace inyectando un estándar de concentración conocida de cada compuesto de interés y se miden las alturas o áreas de cada pico resultante. Una vez realizado este procedimiento, se inyecta la muestra de concentración desconocida y se miden las alturas o áreas de los picos; entonces la concentración de la muestra se obtiene comparando las alturas o áreas de ésta con las del estándar. En los cálculos de integración para electroforesis capilar se utilizan integradores electrónicos o computadores tal como se usa en HPLC o cromatografía de gases.

En el caso de un análisis cualitativo se hace, igual al caso anterior, inyectando un estándar y se registra el espectro de cada pico resultante en la longitud de onda específica del compuesto y se compara con el del patrón. (9, 14, 16)

Materiales y Método.-

Para los análisis se utilizó un equipo de EC marca Hewlett Packard con Detector de Arreglo de Diodos. La metodología de análisis consistió en pesar aproximadamente 1g de muestra de premezcla vitamínica con la que se enriquece una de las marcas de harina de maíz mas reconocidas del país. Esta muestra fue tomada directamente de la línea de producción de la empresa productora de harina. La extracción de las vitaminas de la muestra se realizó con una solución de HCl 0,1N agitando manualmente, cada muestra se inyectó directamente por presión (1000mbar*s) en el capilar de sílica fundida (75m m de diámetro interno y de ) en el equipo, se aplicó un voltaje de 25 kV y la corrida se mantuvo a 30°C de temperatura. (15, 17)

Durante el desarrollo del método, se utilizaron diferentes buffers, con la finalidad de estudiar el comportamiento de las vitaminas ante cada uno de ellos y la influencia de dirección del FEO en la corrida. Se empleó, buffer borato 20mM pH 9.0 y acetato 10mM, para FEO normal y acetato 10mM con CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio) 0,5mM (pH 5.5) para FEO reverso.

La identificación de las vitaminas para cada caso se realizó como a continuación se describe:

Análisis con buffer borato 20mM pH 9.0, FEO normal: con este buffer la identificación de las vitaminas se realizó a 266nm de longitud de onda.

Buffer acetato 10mM pH 5.0, FEO normal: con este buffer la identificación de las vitaminas se realizó a 266nm para las vitaminas B1 y B3 y en 444nm para la vitamina B2.

Buffer acetato 10mM con CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio) 0,5mM (pH 5.5), FEO reverso: igual al caso anterior.

En todos los casos la identificación de cada una de las vitaminas se hizo comparando los espectros UV de los picos obtenidos en el análisis con los de los patrones (Figuras 4,5 y 6).

Resultados y Discusión.-

La respuesta del detector: electroforegrama (Figura 3), muestra que se logra una separación rápida y satisfactoria de todas las vitaminas analizadas, utilizando buffer borato 20mM, pH 9.0, a una longitud de onda de 266nm. El primer pico que se observa corresponde a la vitamina B1 que posee carga positiva, luego se detecta la vitamina B3 que es neutra y por ultimo la vitamina B2, que a pesar de ser neutra en su estructura original, puede formar un complejo de borato cargado negativamente por el uso de buffer borato en la corrida, lo que permite separarla de la vitamina B3.

Figura 3. Electroforegrama de vitaminas hidrosolubles, buffer borato 20mM pH 9.0, detección 266mn.

Figura 4: Espectro tipo de Vitamina B1

Figura 5: Espectro tipo de Vitamina B2

Figura 6: Espectro tipo de Vitamina B3

Para el caso de buffer acetato, los resultados experimentales (figuras 7 y 8) muestran que tanto para FEO normal como para reverso, no se logra la separación de las vitaminas B2 y B3, por esta razón se detectaron en dos longitudes de onda, 266nm y 444 nm, esto gracias a que el detector de arreglo de diodos permite hacer un barrido desde 190nm hasta 650nm. Al comparar los espectro de cada vitamina obtenido en la muestra con la de los patrones, se verifica que cada pico corresponde a las vitaminas de interés. En el caso de FEO reverso se puede verificar que las vitaminas son detectadas de manera contraria, es decir, la vitamina B1 que posee carga positiva es detectada de ultimo en la corrida y luego las neutras, de igual manera no se logran separar las vitaminas B2 y B3.

Figura 7. Electroforegrama en 266 nm, buffer acetato 10mM (pH 5.0). FEO normal.

Figura 9. Electroforegrama en 266 nm, buffer acetato 10mM con CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio) 0,5mM (pH 5.5). FEO reverso.

Figura 8. Electroforegrama en 444 nm, buffer acetato 10mM (pH 5.0). FEO normal. Detección de B2

Conclusiones.-

Empleando la electroforesis capilar se pueden identificar, mediante los espectros, las vitaminas B1, B2 y B3 con alta resolución de picos; en las longitudes de onda en las que estos compuestos absorben. La detección de las vitaminas se logra de acuerdo a la migración de cada una a lo largo del capilar ya que el FEO las arrastra con él. La vitamina B1 posee una carga positiva, por lo que debería ser detectada de primero en la corrida; por otra parte, las vitaminas B2 y B3 poseen carga neutra, por lo que se detectarían después de la vitamina B1.

Cuando se habla de FEO normal este es el comportamiento que se espera, sin embargo, cuando se tiene un modificador de los grupos silanoles, como es el caso del buffer acetato + CTAB, se observa un comportamiento reverso. Esto ocurre porque al agregar al buffer una sal de amonio los grupos silanoles se modifican y adquieren carga positiva, haciendo que los aniones del buffer sean atraídos por estas cargas, estos aniones del buffer son atraídos entonces por el cátodo reversando así el FEO y detectando las especies cargadas positivamente de último en la corrida.

Por medio de la EC con FEO normal se pueden separar satisfactoriamente las vitaminas B2 y B3, compuestos neutros, sólo con utilizar un buffer que permite la formación de un complejo de borato con la vitamina B2 cargado negativamente. Con buffer acetato, en FEO normal y reverso, no se logra esta separación, sin embargo, las vitaminas pueden ser detectadas en dos longitudes de onda diferente. En el caso de las vitaminas B1 y B3 pueden ser detectadas en 266nm y la vitamina B2 en 444nm. La desventaja de este método es que en 266nm los picos de las vitaminas B2 y B3 están solapados, por lo que si se desea cuantificar se debe hacer una corrección en las alturas de los picos.

En líneas generales la EC es una técnica versátil que permite obtener picos con alta eficiencia resolutiva en utilizando diferentes modos de separación, de acuerdo a las necesidades del analista, sin necesidad de un sistema de presión como en HPLC, además de una reducción en los costos de análisis debido a las pequeñas cantidades de tiempo, soluciones y muestra utilizados. (4)

Es muy importante destacar que esta metodología se puede adaptar a el análisis de vitaminas en otras matrices, bien para su determinación en las harinas (producto final) que se enriquecen con la premezcla vitamínica, como para otros alimentos o también en fármacos.

Referencias Bibliográficas.-

1. Baker, D. (1995). Capillary Electrophoresis. Techniques in analytical series. NY. USA. pp. 1-4, 7, 20-22, 95.
2. Baudi, S. (1981). Química de los alimentos. Editorial Alhambra Mexicana, S.A. Primera Edición México. Capítulo 6: Vitaminas y Minerales.
3. Beaton, G; Bengoa, I. (1997). Nutrición en medicina preventiva. III Parte. Enfoque para el control de la manipulación. Capítulo XXVI.
4. Cancalon, P. (2003). Vitamin analysis by Capillary Electrophoresis. L.C – GC Europe. CE Currents. pp. 2-4.
5. Champe, H. (2001). Lippincott´s illustrated reviews: Biochemistry. 2nd Edition. Canada. Capítulo 28 y 29.
6. Dartonl, I; Ritu, N. (2002). Fortification strategies to meet micronutrient needs: successes and failures. Proceedings of the Nutrition Society. 61, pp 231-241.
7. Delgado M.; González I.; Sánchez A.; Caribias R. (2002). Separation and simultaneous determination of water – soluble and fat – soluble vitamins by electrokinetic capillary chromatography. Journal of Chromatography A.. 953. pp. 257 – 262.
8. Jaffé, W. (1995). Nutrición base del desarrollo: nutrición, agroindustria y comercialización. Nutrición. Base del Desarrollo. Ediciones CAVENDES, Caracas, Venezuela. pp. 17 – 27.
9. Landers, J. (1997). Hand book of capillary electrophoresis. 2nd. Edition. CRC Press. Capítulos I y III. Florida, USA.
10. Ratko, B. (1999). Vitamins in food fortification. Human Nutrition and Health Vitamins and fine Chemicals Discussion. La Roche & Co. pp. 5,11, 15-19, 22-25.
11. Riviera, J. (2000). Estrategias y acciones para corregir deficiencias nutricias. Revista Bol Med Hosp Infant Mex. Vol 57. Nº 11 México. pp. 641 – 649.
12. Robinson, D. (1991). Bioquímica y valor nutritivo de los alimentos. Editorial ACRIBIA, S.A. España.
13. Rosado, J.; Camacho, R.; Burgues, H. (1999). Adición de vitaminas y minerales a harinas de maíz y de trigo en méxico. Salud Pública de México, Vol. 47, n° 2. pp. 130 – 135.
14. Skoog; Holler; Nieman. (2001) Principios de análisis instrumental. 5ta Edición. Mc Graw Hill / Interamericana de España, S.A.U. Madrid. pp. 843-854.
15. Tomoyoshi, S. (1995). Simultaneous analysis of water – soluble vitamins using capillary electrophoresis. Hewlett Packard. Application Note. Publication number 12-5963-7568E.
16. Wätsing, H; Dette, C. (1993). Precise quantitative capillary electrophoresis methodological and instrumental aspects. Journal of Chromatography, 636. pp. 31 – 38.
17. Zeece, M. (1992). Capillary electrophoresis: a new analytical tool for food science. Trends in Food Science and Technology. Vol. 3. pp. 6 –10.

Autor:

Lic. Anhely Millán Osuna

Valencia, Estado Carabobo, Venezuela. Diciembre 2003