Electroforesis en geles de agarosa
Enviado por Agustín Garrido
Introducción
En este trabajo práctico se utilizó la técnica de electroforesis. Este proceso se basa en la migración de las moléculas con carga neta de una muestra, cuando es sometida a un campo eléctrico, hacia el polo opuesto de su carga. El método no es tan sencillo: primero hay que saber con qué tipo de moléculas estamos trabajando y de acuerdo a esto se elige el procedimiento y los materiales necesarios.
Hay dos fuerzas que determinan la velocidad con que una molécula migrará: la fuerza eléctrica y la de rozamiento. La primera es la responsable de que la molécula en cuestión sea atraída hacia uno de los electrodos. Por esto es que cuanto mayor sea el cociente carga/masa de la molécula mayor será la aceleración con que se mueva. La fuerza de rozamiento tiene una acción opuesta: a mayor rozamiento, menor velocidad de migración. Esta fuerza tiene que ver con el tamaño y forma de la molécula que migra, y con las características del medio en que se mueve.
En este trabajo práctico realizaremos electroforesis para separar moléculas de DNA doble cadena. La carga neta de estas moléculas está dada por los grupos fosfatos: como hay un fosfato cargado negativamente por cada nucleótido y la masa de los cuatro desoxirribonucléotidos es similar, podemos afirmar que el cociente carga/masa será independiente de la secuencia y la longitud de la doble cadena de DNA (todas las moléculas de DNA migrarán entonces hacia el ánodo). Esto quiere decir que no nos tendremos que preocupar por la fuerza eléctrica, ya que las diferencias en la migración estarán dadas exclusivamente por la fuerza de rozamiento. Como las moléculas migran en el mismo medio y todas tienen la misma forma, la velocidad de migración tendrá que ver únicamente con el tamaño de las moléculas (la longitud de la doble cadena, medida en pares de bases). Claro que cuando se corren plásmidos, por ejemplo, no podemos afirmar lo mismo: al tener distintas formas no ocurrirá lo explicado anteriormente. Lo mismo pasaría con RNA o DNA simple cadena que formen apareamientos internos: en esos casos hay que desnaturalizar antes de correr, de modo que resulten cadenas lineales.
Para realizar la electroforesis se utiliza un medio de migración adecuado, de modo que la separación sea eficiente, ya que se necesita que exista una suficiente fuerza de rozamiento para que las moléculas de distinto tamaño se separen. Para ello se utiliza un gel que consiste en una red compuesta por un polímero orgánico (en este caso usamos agarosa, derivado de un polisacárido de un alga) y que aumenta considerablemente la fricción, impidiendo a la vez la difusión de las moléculas a través del medio acuoso en todas las direcciones. Al colocar las muestras de DNA a través de este gel y someterlo a un campo eléctrico durante cierto tiempo, podemos verlas separadas según su tamaño. La rapidez con que migren las moléculas puede ser regulada por la concentración de agarosa disuelta en buffer que usemos: a mayor concentración, mayor compactación de la red y por tanto menor velocidad de migración. La concentración que elijamos dependerá de lo que se quiera separar en cada corrida.
Para la corrida de proteínas, el proceso es diferente. Se suele utilizar una solución de poliacrilamida como gel y además las proteínas deben ser tratadas con SDS (detergente), que permite mantener constante el cociente carga/masa ya que las cargas netas de las proteínas nativas sí dependen de su secuencia. El SDS desnaturaliza y recubre los polipéptidos, aportando carga negativa de forma proporcional al tamaño de éstos. De esta manera, las proteínas tratadas con SDS migran hacia el ánodo, al igual que los ácidos nucleicos.
Una vez separados los DNAs de distintos tamaños, es posible conocer el peso de cada uno ya que el logaritmo del peso molecular es inversamente proporcional a la distancia recorrida desde el lugar de siembra. Es por eso que en cada corrida se hace necesario correr además de las muestras una mezcla de DNAs de pesos conocidos para trazar un gráfico de proporcionalidad. Estas mezclas se consiguen comercialmente y son conocidas como markers.
Metodología:
Preparación del gel:
El gel de agarosa fue preparado por los docentes de la siguiente forma:
Se realizó una solución de agarosa 0,8% p/v en tubo erlenmeyer, disolviéndola en buffer TAE 1x (1gr de agarosa + 125 ml de buffer). El buffer garantiza que durante la corrida el pH se mantenga cercano a 8. Esto es importante ya que la migración del DNA depende de las cargas negativas de los fosfatos, y las cargas dependen del pH del medio (es decir, de los iones cargados del medio). Si el pH del medio fuera muy ácido, posiblemente los fosfatos no se encontrarían ionizados y se afectaría la fuerza eléctrica que posibilita la migración de las moléculas. El buffer TAE 1x se obtiene de una solución stock TAE 50x, que se preparó con 242 g de Tris base, 57,1 ml de ácido acético glacial, 100 ml de EDTA 0,5 M y H2O hasta llegar a 1 litro. Para disolver esta solución de agarosa en buffer se necesitó calentar en un horno microondas (para fundir). Luego se agregó el bromuro de etidio, que al intercalarse en el DNA (se mete entre los nucleótidos apilados), distorsiona la doble hélice y nos permite visualizar las bandas de DNA una vez finalizada la corrida, en un transiluminador ultravioleta. Como el bromuro de etidio es mutagénico al manipular el gel se debe tener guantes, ya que podría provocar errores en la duplicación de nuestras células. Al estar la solución fundida se la volcó en el molde con el peine colocado, eliminando toda burbuja presente, y se esperó hasta que el gel solidifique completamente antes de ser usado (la agarosa al enfriarse forma interacciones entre las moléculas que al solidificarse forma una red). Luego se retiró el peine y se sacó la cinta de los bordes que deben estar en contacto con el buffer. Se colocó el gel en la cuba de electroforesis, y luego se le agregó suficiente cantidad de TAE 1x para cubrir todo el gel.
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