Preparación de la muestra:
Se utilizó el DNA plasmídico obtenido en el TP nº 3, resuspendido en agua MilliQ (en nuestro caso, sin RNasa), del cual se extrajeron con una micropipeta automática -(p20)- 7 ml y se los agregó a un tubo eppendorf con 2 ml de Loading Buffer (azul bromofenol 0,1%, glicerol 15%), mezclándolos cargando y descargando con la micropipeta. El azul de bromofenol es un colorante que permite ver la corrida (corre como si fuera tuviera 500 pb de peso, es decir, está en el frente de la corrida), durante la electroforesis, controlando que la muestra no se caiga del gel o no se dirija a otro pocillo. El glicerol es una sustancia viscosa que le provee mayor densidad a la muestra que se sembrará, evitando que difunda a través del buffer en que está inmerso el gel (o sea, que quede en el pocillo donde se siembra y se mantenga contenido en la calle). El Loading Buffer también contenía un colorante, xylen cyanol, que corre en la misma posición que lo haría una molécula de DNA de 3000 pb. Al tubo eppendorf conteniendo el plásmido y el buffer de siembra se le dio un spin (centrifugación de corto tiempo), para que la fuerza centrífuga lleve la solución al fondo del tubo y no queden gotas en la pared de éste.
Luego se cargó la pipeta con toda la muestra del tubo(evitando cargar burbujas de aire) y se la apoyó en uno de los bordes del pocillo del gel de agarosa, descargando su contenido en el pocillo (llegando sólo hasta el primer tope, nunca hasta el segundo para evitar la formación de burbujas).
Además de los plásmidos preparados por los grupos (algunos pretratados con RNasa y otros no), se sembraron marcadores de peso molecular conocido (markers), plásmidos pCR previamente digeridos con una enzima de restricción (BamHI), con dos(Bam HI y EcoRI,) o sin digerir, y el plásmido pYES (sin digerir).
Se conectó la cuba que contenía al gel a un electrodo, con el polo positivo en el lado opuesto al sitio de siembra. El buffer en que está inmerso el gel posibilita además que circule corriente eléctrica, ya que presenta iones (el agua destilada no conduce electricidad, por eso no se puede utilizar como medio de corrida). Se corrió a voltaje constante (3-5 V/cm) hasta que el azul de bromofenol haya migrado aproximadamente 10 cm.
Luego, se apagó la fuente y se expuso al gel a radiación ultavioleta (colocado en un transiluminador ultravioleta). Entonces se le tomó una fotografía al gel para analizar y discutir los resultados luego.
Resultados y discusiones:
Tabla generada a partir de los datos brindados por el marker:
PM (pb) log PM Distancia (mm)
3054 3,485 19
2036 3,309 22
1636 3,214 24
1018 3,008 28
506 2,704 34
396 2,598 36
Con esta tabla de valores fue posible configurar el gráfico de log PM en función de la distancia. Luego, a partir de este gráfico y midiendo las distancias de ciertas bandas en el gel, se lograron los siguientes resultados:
-pCR cortado con BamHI (una banda)
Banda:
Distancia= 18mm
log PM= 3,54 (por Gráfico de log PM= f (distancia))
PM= 3467 pb (PM= elog PM)
De acuerdo a este resultado podemos decir que el peso aproximado de pCR es de 3467 pb
-pCR cortado con BamHI y EcoRI simultáneamente (dos bandas)
Banda Chica:
Distancia= 33mm
log PM= 2,78 (por Gráfico de log PM= f (distancia))
PM= 603 pb (PM= elog PM)
Banda Grande:
Distancia= 19mm
log PM= 3,48 (por Gráfico de log PM= f (distancia))
PM= 3020 pb (PM= elog PM)
Si sumamos los pesos correspondientes a ambas bandas, tenemos un peso total de 3623 pb. Este peso es igual (teniendo en cuenta el error de medición) al hallado a partir de la banda de pCR cortado con BamHI (3467 pb), lo cual era de esperar.
pYES sin cortar (tres bandas):
Una de las bandas corresponde a la forma lineal del plásmido (la del medio):
Distancia= 13mm
log PM= 3,8 (por Gráfico de log PM= f (distancia))
PM= 6310 pb (PM= elog PM)
El peso de 6310 pb es el esperado (en el TP se nos dio el dato del peso de pYES= 6200 pb), teniendo en cuenta los errores de medición.
Si se daña mecánicamente al DNA plasmídico cuando se pipetea la solución o al agitarla, se pueden cortar una o las dos cadenas del plásmido, por lo que se verán cambios en el patrón de la corrida: en vez de verse una sola banda (la correspondiente a los círculos covalentemente cerrados, o sea, las moléculas superenrolladas), se podrán ver dos bandas más, en el caso de que se corten algunas moléculas en una sola cadena y otras en las dos cadenas, o sólo una banda más si los plásmidos se cortan de una sola de las dos formas posibles. Vale aclarar que también puede haber formas intermedias, de acuerdo a esta diferente relajación de los plásmidos (es decir, de acuerdo a la cantidad de nicks), pero posiblemente sólo podamos detectar tres como máximo ya que las formas intermedias estarán presentes en poca cantidad.
Las moléculas que más migran hacia el polo positivo son la superenrolladas, ya que pueden atravesar más fácilmente la red de agarosa (al ser más compactas) porque siempre chocan con ésta de igual forma. La banda intermedia que se revela al exponer el gel a luz UV corresponde generalmente a las moléculas lineales (ambas cadenas presentan nick) ya que en solución éstas rotan todo el tiempo y dependiendo de cómo atraviesan el gel se va a dar la migración. Por último, las moléculas que migran con menor intensidad hacia el polo positivo son las de circulo abierto (sólo tienen nick en una de las cadenas), ya que estas moléculas son mas laxas y presentan por ello mayor dificultad para atravesar la malla del gel.
El patrón de tres bandas correspondientes a estas tres formas puede ser observado en las calles en que se sembró pYES sin digerir y pCR sin digerir. Ambos presentan tres bandas, pero en el primer caso abunda la forma círculo abierto mientras que en el caso de pCR abunda la forma lineal (eso podría deberse a que es un preparado viejo y está bastante dañado mecánicamente). En el caso de pYES pudimos comprobar que la banda intermedia correspondía a la forma lineal, ya que al calcular el PM según el gráfico, el resultado fue el peso del plásmido, dado como dato en el TP.
Si se trata a la preparación con el plásmido con una enzima de restricción que tiene un sitio de corte se observa una sola banda, que corresponde a la banda (si se trata del mismo plásmido) de moléculas lineales del plásmido sin digerir, ya que la enzima de restricción(si se la deja el tiempo suficiente y en condiciones óptimas) rompe la doble cadena de todos los plásmidos, por lo que las moléculas quedarán lineales y no habrá superenrolladas o laxas. Esto se puede observar en la calle en que se sembró pCR digerido con BamHI (un sitio de corte). Se ve que la banda es la misma en peso que la correspondiente a la forma lineal de pCR sin digerir.
Si al tratar una preparación de DNA plasmídico (del que no se conoce el mapa) con una enzima de restricción aparecen dos bandas no se puede asegurar que existan dos sitios de corte para esa enzima ya que puede cortar en un solo sitio y se puede cortar en otro sitio, generando otro fragmento, por acción mecánica al pipetear o al agitar la solución; también puede ser la solución no estuviera completamente purificada y presentara otra enzima de restricción, dando como resultado en la corrida dos bandas diferentes. En nuestro caso observamos dos bandas al cortar con dos enzimas de restricción que encontraran un sitio de corte cada una (pCR digerido con EcoRI y BamHI). Al calcular los pesos correspondientes a cada banda, comprobamos que la suma de ambos era igual al peso total del plásmido, según lo esperado.
Las calles correspondientes a las muestras cuyos plásmidos fueron resuspendidos en agua MilliQ (sin RNasa) (grupos 9, 10, 11, 12, 1, 3, 6 y 7) presentan una banda muy gruesa (la que más migró hacia el polo positivo) que corresponde a un chorreado de RNA, que distorsiona el tamaño de las bandas correspondientes al DNA y su forma de migración Además las bandas de DNA se tiñen menos porque el RNA acapara al bromuro de etidio. La banda de RNA es muy gruesa ya que hay moléculas de RNA de distintos tamaños que no fueron degradas al no haber RNasa.
Las calles correspondientes a las muestras cuyos plásmidos fueron resuspendidos en agua MilliQ con RNasa (grupo 8, 2, 4 y 5) no presentan este chorreado, ya que la enzima corta a las moléculas de RNA en fragmentos muy cortos que migran muy rápido y caen del gel, por lo tanto las bandas de DNA se ven nítidas y no están distorsionadas como en los otros casos.
Autor:
Agustín Garrido
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