Aislamiento de bacterias benéficas de raíz y su efecto sobre el crecimiento de maíz

1. Resumen
2. Introducción y antecedentes
3. Material y métodos
4. Resultados y Discusión
6. Bibliografía
7. Anexo

Resumen

El aislamiento y la selección de bacterias benéficas de raíz (BBR) para inocular maíz a dosis reducidas de fertilizante nitrogenado (FN), es parte de una estrategia que no afecta negativamente su rendimiento. Las BBR causan un efecto similar al observado cuando el maíz se fertiliza con la forma de N recomendada para esa variedad y región. Los objetivos de este trabajo fueron: i) aislar y seleccionar BBR para la var de maíz H-417 ii) analizar el efecto de inoculación de las BBR sobre el crecimiento del maíz.

Las BBR se aislaron de raíces de maíz var H-417, en agar D y D. posterior a su purificación se sometieron la prueba de reducción de acetileno (ARA) para detectar su capacidad de fijar N2. El maíz se inoculo y cultivó en arena estéril en el sistema hidropónico de jarras de Leonard en invernadero. Las variables respuesta evaluadas para el efecto de las BBR sobre el maíz fueron: alturade la planta, peso fresco, seco, contenido de proteína y nitrógeno total.

Los resultados muestran un efecto positivo de las BBR sobre el crecimiento del maíz en términos del incremento en su peso seco, por ciento de proteína y nitrógeno total, en comparación con el maíz sin inocular y fertilizado con nitrato de amonio. Lo anterior indica que una selección cuidadosa de las BBR aumenta la probabilidad de una respuesta positiva del maíz a la inoculación con estas rizobacterias y mejoraa el uso del FN, sin daño ambiental.

Palabras clave: Rizobacteria, fitohormonas, exudados radicales.

Introducción y antecedentes.

El maíz es un cereal de consumo básico en México y el mundo, requiere aplicación continua de fertilizante nitrógenado (FN) como otras gramíneas domesticas (Behling y Boddey, 1987; Baldani et al., 2000). El FN en general no se usa en este cultivo no se aplica racionalmente, ello causa perdida de fertilidad del suelo, eleva el costo de producción de este grano, además reduce su área de cultivo y en consecuencia el país tiene que importarlo (Pérez-Moreno Ferrera-Cerrato, 1996 y Sánchez-Yáñez et al., 1997).

Una estrategia para intentar minimizar y optimizar el empleo del FN, es el aislamiento, selección e inoculación del maíz a la siembra con bacterias benéficas de raíz (BBR), las cuales aumentan la absorción radical del FN por estimulación fitohormonal (Berge et al.,1991; García et al.,1995; Sánchez-Yáñez et al., 1998; Jacoud et al., 1999; James, 2000) a dosis inferiores de la FN recomendada para la región, con ello se evita la contaminación ambiental, se ahorra en el costo de producción y se alarga la vida útil del recurso suelo (Valdivia, B., et al., 1997; Valdivia et al., 1999; Sturtz y Nowak, 2000; Reis, et al., 2000). Los objetivos de este trabajo fueron: i) aislar y seleccionar BBR para la variedad de maíz H-417 ii) analizar el efecto de esas BBR sobre el crecimiento del maíz en invernadero.

Material y métodos.

I. Origen de las BBR y semillas.

Las BBR se aislaron de raíces de maíz variedad H-417 del Campo Agrícola Experimental de Río Bravo (CAERIB), estado de Tamaulipas en el noreste de México, según el método escrito por Llovera et al., (1994) que consiste en la agitación de raíces y su desinfección con alcohol absoluto/5 min, lavado con agua estéril tres veces con hipoclorito de sodio al 5% por 2/min, lavadas con agua destilada estéril, trituradas en motero para sembrar luego en agar D y D semisólido en tubo y en caja de Petri con agar 18g/L en el D y D con la siguiente composición química g/L: KH2 PO4.. 0.4; K2H PO4..0.6; MgSO4 7H2O.. 0.0.2; NaCl ..0.1; CaCl 0.02; NaMo04 .2 H2O 0.02; trazas de FeCl; 4.0 ml de una solución alcohólica de azul de bromotimol al 0.5%; 50g de malato de sodio (Merck) esterilizado por filtración (membrana milipore Gelman 0.2 µ). El medio de cultivo se ajusto a un pH de 6.8 con NaOH 0.1M (Chelius y Triplett, 2000). Se inocularon tubos de 16 x 150 mm con 2 ml de D y D y un 0.05% de agar, la cepa de Azospirillum brasilense de Brasil fue proporcionada por el Dr. Ferrera-Cerrato del laboratorio de microbiología de suelos del Colegio de Postgraduados, Montecillos, Edo, México, México. Las semillas de maíz (Zea mays L) var. H-417 fueron donadas por el Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas de Zaragoza, Coahuila, México.

Las BBR se mantuvieron por resiembra periódica en agar nutritivo cubierto con aceite mineral estéril entre 10-15°C.

II. Prueba de reducción de acetileno (ARA), o fijación de N2.

La demostración de la fijación de nitrógeno o ARA se realizó con los cultivos bacterianos axénicos puros de acuerdo con Loera et al., (1996). Los aislados de raíces de maíz se crecieron en el agar D-D se incubaron a 30°C por 48 h, luego con una manguera de hule de 10.0 mm de diámetro se les agregó una mezcla de argón-oxígeno en relación 95:5 para cambiar la atmósfera del tubo se cerraron con tapones de hule de ampolleta; con una jeringa para gases Hamilton de 5 mL, se les extrajo el 10% de la fase gaseosa y se les inyectó el 10% de acetileno, este gas se generó al reaccionar 5.0g de carburo de calcio y 20 mL de agua en un matraz Kitasato de 500ml cerrado con un tapón de hule, y conectado a una torre de lavado mediante una manguera de hule de 10/mm de diámetro. El acetileno producido en cada tubo se extrajo con jeringa después de 0, 2, 3, 4 y 6h de incubación a 30°C, se analizó en un cromatógrafo de gases Beckman GC-72-5 con detector de ionización de flama, con una columna de Porapak N de dos metros por cuatro mm. de diámetro a 50°C y nitrógeno como gas de arrastre (25ml/min) según el método descrito por Barber et al., (1976), Baldani et al., (1986), Elbeltagy et al., (2000).

III. Inoculación del maíz en el invernadero.

Las semillas de maíz variedad H-417 se sembraron en jarras Leonard la gramínea se alimentó, con una solución mineral de White, con la siguiente composición química: K2HPO4 1M-1mL; KH2PO4 1M-1mL; MgSO4 7H2O 1M-1mL; CaCl2; 2H2O 1M-1mL; FeSO4 trazas; solución de elementos menores: (ácido bórico-2.68 g; ZnSO4 7H2O 0.22 g KCL-0.09g; Na-Mo04-trazas; agua destilada 100 mL; pH 7.0) se utilizó un 1.0 mL; agua destilada-1000 mL. Se dejaron 2 plantas de maíz por jarra de Leonard (Luna y Sánchez-Yáñez, 1991). El control relativo fue el maíz fertilizado con NH4NO3, 1M-1mL/L en arena, con repeticiones por tratamiento. Las plantas se mantuvieron durante 14 semanas, al terminar este período las variables respuestas evaluadas fueron: altura máxima alcanzada, peso fresco y seco (60°C/72 h) nitrógeno total por el método Kjeldhal y proteína según la A.O.AC. (Llovera et al., 1994).

IV. Identificación de las BBR.

La identificación se basó en los criterios de Luna y Sánchez-Yáñez (1991), Llovera et

al., (1994), Loera et al.,(1996), que consideran reacción al Gram, patron de oxidación/fermentación de carbohidratos, actividad proteolítica: caseína, urea, gelatina y la respiratoria.

Resultados y Discusión.

I. Aislamiento de las BBR.

La BBR fijadoras de N2 recuperadas de la variedad de maíz H-417 se obtuvieron una por la técnica de agitación y la otra por la de trituración de raíces se observo que ambas BBR mostraron una evidente ARA y que provenían de raíces expuestas en agitación, lo que sugiere que por lo menos una fue dominante en el rizoplano o en células epiteliales de la raíz del maíz como se reporta para Azospirillum de manera frecuente (Jacoud et al., 1999).

Actividad reductora de acetileno (ARA) o fijación biológica del N2.

En el cuadro 1 se muestra que la ARA fue positiva y gradual para la BBR de maíz durante el período de incubación, estos valores fueron relativamente normales en comparación con lo que se reportan para otras bacterias similares de gramíneas (Baber et al., 1976; Baldani et al., 2000) al considerar que el medio de cultivo en el cual crecieron y a condiciones nutricionales que afectan la fijación de nitrógeno son dependientes del tipo de BBR.

Evaluación de la inoculación del maíz con las BBR.

El cuadro 2 presenta el efecto de las BBR sobre el maíz H-417, donde se observa que A. lipoferum causo un aumento en el peso seco, en el por ciento de proteína y en el N total el cual fue superior al efecto observado en el maíz inoculado con A. brasilense y Azotobacter beijerinckii (Az. beijerinckii), los cuales a su vez superaron al maíz solo fertilizado con N y obviamente al maíz sin inocular y sin N, estos datos concuerdan con los reportados por otros trabajos en los que Burkholderia spp causó un incremento en el peso seco de una variedad de maíz y además mantuvo un rendimiento similar al observado en el maíz usado como control relativo (García et al.,1995; Reis, et al., 2000; García et al.,2005;) en donde la inoculación de BBR en maíz dosis reducidas de FN causó un efecto positivo sobre su crecimiento así como se reporta para otras gramíneas (Baldani, et al., 2000; Reis et al., 2000) en este sentido la inoculación es una alternativa para la producción de maíz (Sturtz y Nowak, 2000). Las BBR aceleran la actividad radical mediante la absorción eficiente del N a dosis reducidas (Valdivia et al., 1997; García et al., 2001, García et al.,2005). A. lipoferum fue la BBR que causó el mayor efecto positivo sobre el por ciento de proteína como se reporta en otras gramíneas que se inoculan con BBR (Elbeltagy et al., 2000; Chelius y Triplett, 2000). El cuadro1 también se muestra que el por ciento de proteína de N total, del peso seco y fresco del maíz inoculado fue equivalente o mejor al similar del maíz usado como control relativo. En general A. lipoferum influyo positivamente sobre el desarrollo de los diferentes tejidos del maíz, lo que no se observó en el maíz inoculado con las otras BBR como A. brasiliense incluso en el maíz usado como control relativo (García et al., 1995; Reis et al., 2000).

Identificación de las BBR

En el cuadro 3, se indican los resultados de las pruebas bioquímicas de identificación de las BBR. Como se indica BBR denominada S-17 no hidrolizó la gelatina, ni la caseína. Fue positiva a la producción: de ureasa, catalasa y oxidasa: utilizó los citratos como única fuente de carbono y energía. Redujo los nitratos a nitritos: tuvo una reacción negativa a la prueba de Voges Proskauer, rojo de metilo e indol; no formo ácido sulfhídrico en el agar triple azúcar–hierro (TSI), ni en ácido y/o gas de ribosa, maltosa, sacarosa, rammosa, lactosa y xilosa, de la glucosa fue débil. Estos datos indican que S-17 corresponde a Azospirillum lipoferum según Llovera et al., (1994) y Loera et al., (1996) con excepción de que este aislado oxida la glucosa y reduce los nitratos apoyado en la morfología de la figura 1 al microscopio electrónico como bacilos típicos del genero Azospirillum.

En lo que respecta al aislado S-12 su patrón bioquímico indica que se trata Azotobacter de la especie: beijerinckii, por la producción de quistes y por la carencia de movimiento como por la incapacidad para hidrolizar el almidón, como se reporta en la literatura (Baldani et al., 1986; Baldani et al., 2000) para BBR de este tipo.

Conclusión.

Se concluye que el aislamiento de BBR del tipo de A. lipoferum a variedades de maíz representan en alternativa para producir esta gramínea a dosis reducidas de FN bajo un esquema de producción sustentable de este tipo de gramíneas..

Dedicatoria.

Al Dr Eduardo Aguirre-Pequeño, fundador de la FCB, de la facultad de Agronomía , luchador social, comprometido con la salud en todo nivel, estudioso de la gerantología, filósofo y maestro sin comparación de la UANL y el estado de Nuevo León, México.

Agradecimientos

A la CIC de la UMSNH proyecto 2.7 (2005-2006) por las facilidades para la publicación de este trabajo. A la Facultad de Ciencias Biológicas de la UANL por el apoyo económico y el microscopio electrónico

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Anexo

Cuadro 1. Actividad de reducción de acetileno (ARA) o fijación biológica del N2 por rizobacterias benéficas de raíces de maíz (Zea mays L) var. H-417.

La prueba se realizó con las bacterias crecidas en D-D semisólido a 30° C/12 h. Todos los valores son el promedio de 4 repeticiones. ND=No determinado. *Donada por Dr. T. Van Van, Lab Ecología microbiana Universidad Claude Bernard, Lyon, Francia, **Colección Lab. Microbiología Ambiental, IIQB-UMSNH.

Cuadro 2. Efecto de la inoculación de rizobacterias benéficas de raíz sobre crecimiento de maíz (Zea mays L) variedad H-417.

Realizado en jarra de Leonard, 8 repeticiones. Letras iguales sin diferencia estadística según Tukey (P<0.05) todos los valores son el promedio de 16 plantas. *Control relativo, ** control absoluto.

Cuadro2. Identificación bioquímica de las bacterias benéficas de raíces del maíz H-417 de Río Bravo, Tam.

(D*) Reacción débil (+)=Reacción positiva (-)= Reacción Negativa. **Cepas donadas por el laboratorio de Microbiología del Suelo. Colegio de Postgraduados, Montecillos, Edo. de México.

Figura 1. Morfología al microscopio electrónico de transmisión de Azospirillum lipoferum (S-10) aislada del rizoplano de maíz (Zea mays L) var H-417. (7000X).

S1 Posada. C., J1+

Ruiz-Ordoñez., 2

J. Villegas M

Sánchez-Yáñez, J.M3

1Microbiología Industrial y Suelo, FCB,

1+Unidad de Microscopia electrónica, F Medicina, Universidad Autónoma de Nuevo León, Apdo. Postal 4141, San Nicolás de los Garza, N.L. CP.64000. México. Ecología microbiana2. Microbiología Ambiental3*

*autor correspondiente

Instituto de Investigaciones Químico Biológicas, Ed.B-1, C.U. Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Morelia, Mich., CP.58000. México.