Toxicidad Oral de Seis Insecticidas en Larvas de Vespula germanica (F.) en Laboratorio (página 2)

MATERIALES Y MÉTODOS

Se efectuaron ensayos sobre larvas de V. germanica en el Laboratorio de Toxicología, Facultad de Ciencias Agronómicas, Universidad de Chile, Santiago (33º40’ lat. S.; 70º38’ long. O), entre abril y julio de 2004.  Se colectaron nidos de V. germanica en el campo antes de las 9 AM cuando la actividad de las obreras es menor.  Se identificó la salida del nido sobre el cual se puso una trampa McPhail como las usadas por Landolt (1998), para colectar las avispas emergentes.  Luego, los nidos se extrajeron e introdujeron en baterías de crianza Flanders como las usadas por Curkovic et al. (1995), que se llevaron a 0°C para aletargar a las obreras y seleccionar pisos con larvas de último estadío (n ≥ 35).  Los pisos se mantuvieron posteriormente a 25°C y ~ 50% HR en oscuridad, para simular las condiciones de los nidos en la naturaleza (Parrish y Roberts, 1983).

Se evaluaron seis insecticidas: spinosad (Success 48 SC; 442 g i.a. L-1), fipronil (Regent 250 FS; 250 g i.a. L-1), triflumuron (Alsystin 480 SC; 480 g i.a. L-1), abamectina (Fast 1.8 EC; 18 g i.a. L-1), metoxifenocide (Intrepid 240 SC; 240 g i.a. L-1) y Bacillus thuringiensis kurstaki (Dipel 2X; 64 g i.a. kg-1).

Las formulaciones de insecticidas se mezclaron con una solución de 30% de miel (Harris y Etheridge, 2001). Se evaluaron 5-6 concentraciones por insecticida con un número variable (n = 35-49) de larvas por concentración. Cada larva se alimentó una sola vez con 1,5 mL de solución insecticida mediante una micropipeta, y luego con solución de miel sin insecticida, al menos una vez por día hasta que sellaron la celdilla (operculada). Antes de cada alimentación se removieron sus secreciones salivales con una pipeta Pasteur, como lo sugieren Parrish y Roberts (1983) para eliminar un factor de mortalidad. Para triflumuron la primera concentración evaluada (0,24 g i.a. L-1) se definió por la literatura (IMPPA–AFIPA–SAG, 2002-2003), pero en los demás insecticidas fue necesario efectuar pruebas preliminares para definir aquellas que permitieran obtener niveles de mortalidad cercanos al 80%.  Luego se evaluó una serie de concentraciones decrecientes en una escala aproximadamente logarítmica hasta obtener cerca del 20% de mortalidad larvaria.  Los rangos de concentración evaluados (en mg i.a. L-1) fueron: abamectina 6,8–0,84; fipronil 1.000–1; metoxifenocide 9.600–60; spinosad 106 – 0,11; y triflumuron 24.000–2,4; y B. thuringiensis 640–5,1 mg kg-1).

Una vez alimentadas las larvas, los pisos respectivos se mantuvieron en cámara de crianza, bajo las condiciones descritas.  Se evaluó la condición de los individuos bajo lupa estereoscópica (10-20x), y se determinó el número de larvas muertas hasta 96 h después de la administración de los insecticidas neurotóxicos (spinosad, abamectina y fipronil), y hasta el momento en que emergieron adultos del testigo para los demás productos (B. thuringiensis, metoxyfenocide y triflumuron), debido a su lento modo de acción.

Algunos individuos expuestos a los tratamientos presentaron parálisis, corresponde a la ausencia de movimiento corporal, aunque a veces con movimiento mandibular constante (no ocurrió en larvas sin tratamientos con insecticida),  y/o pardeamiento, que es un cambio de color del amarillo claro en larvas sanas, a pardo oscuro a negro en larvas tratadas.

Para descartar la mortalidad por causas ajenas a la acción del insecticida se dispuso de un testigo (piso con dieta sin insecticida) para cada producto.  Estas larvas se mantuvieron en cámara climática como se describió anteriormente. La mortalidad (%) se corrigió mediante la fórmula de Abbott en caso de alcanzar niveles superiores al 5% en el testigo (Busvine, 1980).  La CL50 para cada uno de los insecticidas, con sus intervalos de confianza (a = 0,05) y los valores de c2 respectivos, se obtuvieron mediante análisis Probit (Rustom et al., 1989) utilizando el programa Minitab (Minitab, 2000), sin incluir el testigo (concentración = 0).  Las CL50 de spinosad, abamectina, fipronil y triflumuron se compararon en función de los intervalos de confianza obtenidos.  Los insecticidas se consideraron estadísticamente diferentes (a = 0,05) cuando no hubo traslape entre ellos (Antonio Rustom, Mg.Sc., Estadístico, Facultad Cs. Agronómicas, U. de Chile, 2004. Comunicación personal).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Todas las larvas muertas presentaron los síntomas característicos de la intoxicación con los insecticidas respectivos, excepto para B. thuringiensis, en que las cuatro larvas muertas no presentaron síntomas (Cuadro 1).  Los parámetros de análisis Probit de los ingredientes activos se presentan en el Cuadro2.

Cuadro 1.  Mortalidad larvaria total (No) de Vespula germanica por cada insecticida. Table 1.  Total larval mortality (No) of Vespula germanica for each insecticide. 

Cuadro 2.  Parámetros de los análisis Probit para los ingredientes activos evaluados sobre larvas de Vespula germanica. Table 2.  Parameters of the Probit analyses of the active ingredients evaluated on Vespula germanica larvae.

Las CL50 (Cuadro 2) fueron estadísticamente diferentes entre todos los ingredientes activos, excepto fipronil y triflumuron, que fueron iguales.  El insecticida más tóxico fue spinosad y el menos tóxico triflumuron.  Los valores de chi-cuadrado satisfacen los criterios indicados por Rustom et al. (1989), esto es, usando el análisis Probit, los resultados de mortalidad se ajustaron a la recta mortalidad–concentración de insecticida.

La evolución de los síntomas observados en larvas se analiza para cada producto; la de los insecticidas neurotóxicos se presenta en el Cuadro 3.

Cuadro 3.  Evolución de síntomas a las 24, 48, 72 y/o 96 h de la exposición a insecticidas neurotóxicos en las larvas de Vespula germanica que finalmente murieron. Table 3.  Evolution of symptoms at 24, 48, 72, and/or 96 h after exposure to the neurotoxic insecticides in the Vespula germanica larvae that finally died.

Spinosad.  Las larvas alimentadas con las dos concentraciones mayores (105,6 a 10,56 mg i.a. L-1) presentaron parálisis total a las 24 h y pardeamiento a las 48 h, hasta volverse negras (Cuadro 3).  Además, las larvas tratadas no presentaron los pliegues abdominales característicos de las larvas sanas.  Con las concentraciones menores (1,056 a 0,1056 mg i.a. L-1) se observaron los mismos síntomas a partir de 48 h.  La mortalidad larvaria fue casi total a las 24 h en las concentraciones mayores, mientras que en las menores aumentó hasta las 72 h.  Las larvas que lograron opercular antes de las 24 h murieron, y aquellas que sobrevivieron pasadas las 72 h opercularon y siguieron su desarrollo normal.

Spinosad controla plagas de varios órdenes de insectos, cuyas larvas ingieren follaje tratado.  Su actividad se presenta a los pocos minutos de la exposición (Thompson et al., 1999).  Los resultados indican que spinosad también tiene actividad sobre Hymenoptera.  Éste insecticida es de origen natural, derivado de la fermentación bacteriana de Saccharopolyspora spinosa Shao-Rao, que produce spinosinas que actúan rápidamente por contacto o ingestión.  Interfiere la transmisión del impulso nervioso entre las neuronas, donde se une a receptores de acetilcolina específicos.  La excitación nerviosa continua produce la muerte del insecto.  Los síntomas en los insectos tratados incluyen contracciones musculares, temblores y postración dentro de las 24 h.  La fatiga muscular conlleva a la parálisis e impide que el insecto se alimente; la muerte ocurre en menos de 72 h (Thompson et al., 1999).  Esto último coincide con los resultados obtenidos en la presente investigación (Cuadro 3).

Fipronil.  Los síntomas de intoxicación fueron evidentes antes de las 24 h en las dos concentraciones mayores (1.000 y 100 mg i.a. L-1), y posteriormente en las menores (10 y 0,1 mg i.a. L-1).  En estas últimas, el síntoma más característico entre las 24 y 72 h fue parálisis corporal, excepto por el movimiento constante de las mandíbulas, el que se mantuvo hasta 48 h.  Además, al igual que con spinosad, no se observaron los pliegues abdominales característicos de larvas sanas.  Luego, las larvas tratadas con las dos concentraciones mayores tornaron de pardo oscuro a negro.  Estos síntomas fueron más paulatinos en las concentraciones menores.  En la concentración mayor, ninguna de las larvas tratadas alcanzó a opercular, lo que sí se observó en las concentraciones menores.  Estos resultados coinciden con los de Harris y Etheridge (2001), quienes a concentraciones de 0,001% de producto comercial (correspondientes a 10 mg i.a. L-1 en este estudio), obtuvieron >50% de celdas operculadas, alimentando cada larva con 5 mL, pero sin emergencia de adultos.  Con la concentración equivalente (10 mg i.a. L-1`), en este estudio también se obtuvo >50% de mortalidad, aunque administrando sólo 1,5 mL por larva.  La concentración de 1.000 mg i.a. L-1 causó 100% de mortalidad.

Fipronil actúa por contacto e ingestión, bloqueando el paso de iones cloro a través de los canales iónicos regulados por el ácido gama-amino-butírico (GABA), por lo que interfiere en el sistema nervioso y, a concentración suficiente, causa la muerte por sobreexcitación (Anonymous, 2000).

Abamectina.  Los síntomas observados después de 24 h (Cuadro 3) fueron similares a aquellos descritos por Barberá (1989) para ácaros, incluyendo parálisis parcial, pero con movimiento constante del aparato bucal.  En las 48 h siguientes se observó pardeamiento, y deshidratación después de 96 h.  Desde las primeras horas se observó una mortalidad progresiva hasta las 48 h.  Las larvas que lograron opercular antes de las 24 h murieron, y aquellas que sobrevivieron pasadas las 72 h opercularon y siguieron su desarrollo normal, al igual que con spinosad.

La abamectina es producida por un actinomicete del suelo, Streptomyces avermitilis Kim & Goodfellow, del cual se obtiene por fermentación.  Actúa por contacto e ingestión y tiene acción translaminar.  Bloquea el impulso nervioso al inhibir el GABA, causando parálisis, muerte, y desecación del ácaro o insecto.  Es muy tóxico para las abejas (Barberá, 1989).  Los insectos tratados dejan de alimentarse y poner huevos, se paralizan, y mueren en un corto período de tiempo (Geden et al., 1990).

Triflumuron.  Los síntomas en las larvas tratadas con triflumuron coinciden con Bellés (1988), i.e., interrupción de la ecdisis y muerte del insecto dentro de la cutícula vieja (Figura 1); sin embargo, en ninguna concentración se observó que la cápsula cefálica antigua permaneciera unida a la nueva.  En algunos casos sólo se rompió el exuvio, y en otros comenzó a desprenderse, pero quedó unido a los últimos segmentos abdominales; hubo pérdida de líquido y el insecto murió pardeado.  La permanencia de la antigua cápsula cefálica adherida a la nueva, el desplazamiento de mandíbulas y labro, y obstrucciones en el tubo digestivo, dificultan la alimentación de individuos que aparentemente mudan con normalidad, y conduce finalmente a la muerte del insecto (Bellés, 1988).

Figura 1. Larva alimentada con solución de miel al 30%, conteniendo 0,00024% de triflumuron (p/v). Figure 1. Larva fed with 30% honey solution, containing 0.00024% triflumuron w/v.

En el manual de IMPPA–AFIPA–SAG (2002-2003) se recomiendan 2.400 mg de triflumuron por 10 kg de cebo para el control de la chaqueta amarilla.  En base a esta referencia se comenzó el estudio con una concentración de 240 mg i.a. L-1 de solución de miel.  Con ella se obtuvo cerca de 70% de mortalidad, mientras que las dos concentraciones mayores causaron alrededor de 90%.

El triflumuron tiene largo efecto residual y actúa principalmente por ingestión, pero también por contacto.  Los insectos mueren al interferirse la formación de quitina durante la muda, aparentemente por inhibición de la enzima quitin-sintetasa.  Una cutícula deficiente se traduce en que el individuo no puede resistir la presión de turgencia, lo que produce lesiones que causan la muerte (Bellés, 1988).  Es más efectivo sobre los primeros estados larvarios y puede afectar también la formación y eclosión de huevos (Barberá, 1989).  En este estudio se utilizaron larvas de último estadío, por lo que los resultados de mortalidad serían mayores en larvas más jóvenes.

Metoxifenocide.  Las concentraciones evaluadas (960 a 60 mg i.a. L-1) no tuvieron efecto sobre las larvas.  Por ello se evaluó, además, una concentración 10 veces superior (9.600 mg i.a. L-1) (Figura 2) a la concentración mayor considerada originalmente, la que causó 100% de mortalidad larvaria.  Ello sugiere la necesidad de evaluar nuevamente este plaguicida para definir la CL50 con más concentraciones entre las dos mayores evaluadas.

Figura 2. Larvas alimentadas con solución de miel al 30%, conteniendo 0,0096% de metoxifenocide en p/v (derecha) vs. solución de miel al 30% sin insecticida (control). Figure 2. Larvae fed with 30% honey solution containing 0.0096% methoxyfenozide w/v vs. 30% honey solution without insecticide (control).

Las larvas afectadas por metoxifenocide presentaron primero pérdida de la capacidad de respuesta al estímulo alimentario evidenciado por la ausencia de movimiento de las mandíbulas, y luego murieron antes de mudar.  Síntomas similares fueron descritos para Bombyx mori L. (Lepidoptera: Bombicidae) por Bellés (1988) con una dosis muy elevada de 20-hidroxiecdisona (= ecdisona).  Otra causa de la mortalidad puede ser el solvente u otros componentes de la formulación comercial administrada a las larvas, en la concentración utilizada.

El metoxifenocide acelera la ecdisis (muda) al emular la actividad de la ecdisona; actúa principalmente por ingestión en larvas de lepidópteros (IMPPA–AFIPA–SAG, 2002–2003).  Los efectos de la administración de ecdisona exógena se observan en la cutícula durante la muda, al permanecer algunas características morfológicas de la fase anterior.  También se interrumpe o inhibe el crecimiento, y ocurren defectos en la maduración de los órganos sexuales y de los huevos, cuerpo graso, aparato digestivo, sistema excretor, etc.  Estas respuestas dependen de varios factores, como la dosis, edad y exposición a la hormona (Bellés, 1988).

Bacillus thuringiensis.  Las larvas no fueron afectadas por la cepa de B. thuringiensis evaluada en las concentraciones aplicadas, y por ello no se estableció la CL50.  Una concentración 10 veces mayor que la máxima evaluada originalmente tampoco causó síntomas de toxicidad.  Las larvas tratadas con B. thuringiensis se desarrollaron normalmente y los adultos emergieron al igual que en el testigo.  La actividad larvicida prácticamente nula puede explicarse por la ausencia de las condiciones que activan las toxinas en el estómago.  Ello podría estar asociado con un pH inadecuado en el tracto digestivo y/o a la ausencia de receptores específicos que permiten la unión de las toxinas con su pared interna, lo que evitaría la destrucción del sistema digestivo y la consecuente septicemia por la acción de las esporas y sus toxinas (Federici, 1999).  La ausencia de efectos nocivos de B. thuringiensis en Polistes (Vespidae) y otros himenópteros (Bellés, 1988) coincide con la falta de actividad observada sobre V. germanica.  No obstante, Feitelson (1993) y Lamborot y Araya (1986) indican alguna actividad sobre Hymenoptera, y Silva et al. (1980) encontraron alguna actividad sobre Caliroa cerasi L. (Tenthredinidae).

B. thuringiensis es un insecticida microbiológico que incluye cristales proteicos (endotoxina) en el cuerpo parasporal y esporas de la bacteria (Federici, 1999).  La bacteria y/o toxinas deben ser ingeridas por la larva; la actividad del cristal depende del pH y de la acción de enzimas proteolíticas en el tracto digestivo.  El cristal es una protoxina, que al ser activada por hidrólisis enzimática libera proteínas tóxicas solubles, lo que produce parálisis intestinal; la larva deja de alimentarse y permanece inactiva e inmóvil durante un período variable, dependiendo de factores ambientales y del vigor y edad de la larva (Lamborot y Araya, 1986).  La muerte de las larvas ocurre por toxemia (patología causada por las toxinas en la hemolinfa), septicemia (multiplicación de patógenos en la sangre y tejidos), o inanición (Barberá, 1989).

CONCLUSIONES

Las larvas expuestas a los insecticidas neurotóxicos spinosad, fipronil y abamectina presentaron rápidamente síntomas como parálisis y pardeamiento de la cutícula y mortalidad en períodos menores a 48 h.

Triflumuron también tuvo actividad sobre larvas, con síntomas como interrupción de la ecdisis y ruptura parcial de la cutícula, característicos para el modo de acción, pero en períodos más prolongados (> 48 h), causando finalmente la muerte.

Spinosad fue el insecticida más tóxico, seguido de abamectina, fipronil, y por ultimo triflumuron.  Las CL50 expresadas en mg i.a. L-1, fueron: spinosad, 0,29 abamectina, 1,4; fipronil, 3,4; triflumuron, 12.

Metoxifenocide no tuvo efecto letal sobre larvas tratadas en el rango de concentraciones evaluadas (960 a 60 mg i.a L-1).  Sin embargo, la evaluación posterior de una concentración 10 veces mayor (9.600 mg i.a. L-1) causó 100% de mortalidad larvaria.

Bacillus thuringiensis kurstaki no tuvo efecto tóxico sobre larvas desarrolladas de V. germanica en el rango de concentraciones evaluado (64 a 0,512 mg i.a. L-1), ni tampoco al aumentar la concentración 10 veces (640 mg i.a. L-1).

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Alvaro Ulloa K.1, Tomislav Curkovic S.1 y Jaime Araya C.1 1 Universidad de Chile, Facultad de Ciencias Agronómicas, Casilla 1004, Santiago, Chile.