Rhizobium etli es una rizobacteria benéfica del fríjol porque fija N2 en los nódulos de sus raíces, cuando estas plantas se siembran en el suelo sin suficiente nitrógeno inorgánico combinado, que supla la demanda nutricional del fríjol. Mientras que para evitar que insectos-plaga anulen este efecto positivo de R. etli en la leguminosa. En la agricultura convencional es necesario aplicar pesticidas para protección de los cultivos vegetales.
Los resultados de este trabajo indican la factibilidad de seleccionar R. etli que conserve su capacidad de nodular y fijar N2, al mismo tiempo que sea tolerante a pesticidas, lo que asegure su efecto positivo en la producción sostenible de fríjol.
Palabra clave: Simbiosis, nódulo, plagas, eficacia.
La fijación biológica de nitrógeno atmosférico (FBN), constituye una fase clave del ciclo del nitrógeno en la naturaleza, su forma molecular N2 no es absorbida por los eucariotes como las plantas excepto por ciertos procariotes, aunque las leguminosas lo hacen directamente en simbiosis con la bacteria del género Rhizobium (Alexander 1971, 1977).
La simbiosis representa un avance evolutivo trascendental aplicable a la agricultura para el aprovechamiento racional de recursos naturales. Sin embargo la producción sostenible y segura de fríjol requiere pesticidas que eliminen los insectos-plaga que lo atacan, peor que no afecten la actividad de beneficios de R. etli.
Al respecto la información sobre R etli es contradictoria (Claridge y Schimitz 1978; Ferguson y Korte 1977). Ya que se reporta que R. etli se inhibe con concentracione bajas de DDT y Folidol, inferiores a las que se recomienda en el campo para el control de insectos-palga, en contraste se reporta que otras bacterias del suelo, los metabolizan al usarlos como fuente de carbono y energía (Ruplal y Saxena, 1982), como los géneros: Pseudomonas, Streptomyces, Micromospora, Thermoactinomyces, Nocardia y Mycobacterium (Das y Murherjee 2000; Kantachote et. al. 2001).
Acorde con estos reportes la nodulación por Rhizobium en las leguminosas se anula o reduce por pesticidas (Alexander, 1971, 1977), porque en principio éstos afectan la viabilidad de la bacteria además de la capacidad de R etli para nódular raíces, en consecuencia la posibilidad de la FBN (Sommerville y Greaves, 1987).
Los objetivos de este trabajo fueron aislar y seleccionar Rhizobium etli benéfico para fríjol resistente a diazinón.
I.- Origen y mantenimiento de R.etli:
Los aislados de R. etli resistentes a pesticidas, se obtuvieron de fríjol de acuerdo al criterio de Vincent, (1975) colectados del campo agrícola experimental del Río Bravo (CAERIB), del INIFAP, de Río Bravo, Tamaulipas, México, se designaron con las claves: C-6, G-2 y R-I,
Los aislados se resembraron en Agar Extracto de levadura manitol Rojo Congo (AELMRC) g/L: K2HPO4 0.5; MgSO4 0.2; NaCl 0.1; manitol 1.0; extracto de levadura 1.0; rojo congo 10.0 ml/L (de una solución 1;500); agar-agar 20.0; agua destilada 1000.0 ml; pH 7.0
Cuadro No. 1. Características de Rhizobium etli silvestre de este trabajo previo a su selección natural para tolerar pesticidas, infectivos y efectivos.
Aislados (clave designada)
C-6
C-2
R-1
No. de nódulo/planta
*27c
23c
40ª
Altura de planta (cm)
23c
23c
30c
Color de hojas
verde intenso
verde
Verde intenso
*letras iguales son estadísticamente similares según Tujey (p<0.05). n=10.
- Activación de aislados de R. etli
En este ensayo se utilizaron tres pesticidas de uso común en Río Bravo, Tam. México, Diazinón (0,0-Dietil, 0-2, isopropil, 4-mentil pirimidil, 6-fosforotionato) – Kevin (I – Naphyl –N- methycarbamato), c/pesticida se agregó al AELMRC en concentración de: 250, 300, 500 y 100 ppm.
Los aislados de R. etli se sembraron en matraz nefelométrico, se incubaron de 24 a 36 h, en agitación/200 rpm, paralelamente se observó: la forma, el color y el tamaño de as colonias en AELMRC al tolerar los pesticidas. La adaptación de R. etli a c/pesticida se logro por incremento gradual, que es una estrategia de selección natural de mutantes.
- Selección de R. etli mutante resistente a pesticidas:
- Prueba de infectividad y efectividad de los mutantes de R. etli resistentes a diazinón.
Los mutantes de R. etli adaptados al pesticida que conservaron su capacidad de nodular y de fijar biológicamente N2, se incubaron en semillas de fríjol con el pesticida, previa desinfección, se sembraron en jarras de Leonard (Vicent, 1975). La planta se alimento con una solución mineral para vegetales. Está se preparó de la siguiente manera: 1 molar de K2HPO4, KH2PO4, CaCl2, MgSO4, H2O, trazas de FeSO4;1 ml de solución de elementos menores en 1000 ml de agua destilada; pH 7 y se pasteurizó (90°C/10min) en inverandero por 45 dias, para ello la planta se saco completa de la jarra, y se determino el número de nódulos efectivos en la raíz, así como el peso fresco y seco de esos nódulos, incluso se midió la altura de la planta. Estas variables-respuesta se usaron como indicación de la conservación de la infectividad e efectividad en el R. etli seleccionado por su máxima tolerancia a diazinon.
1.4 Evidencia de que R. etli coometabolizo el diazinón en el medio de cultivo.
R. etli resistente se inoculó en matraz con caldo extracto levadura manitol rojo congo (CELMRC) y el pesticida, el matraz se coloco en agitación constante 300rpm hasta que alcanzar la fase estacionaria a las 30h.
I.- Obtención de mutantes R. etli resistentes a diazinon:
En este trabajo se aislaron mutantes de R. etli resistentes a diazinón que mantuvieron su infectividad y efectividad en el fríjol como se muestra en el cuadro 2, lo que sugiere que la bacteria se adaptado al pesticida, ya que este no causó perdida de los plásmidos dependientes con la nodulación y fijación biológica del N2 (Kantachote et al., 2003).
Cuadro No. 2. Infectividad y efectividad de Rhizobium etli tolerante a diazinón.
Fenología | R. etli silvestre | R. etli mutante | ||||
Diámetro de la hoja | C-6 | R-1 | G-2 | C-6 | R-1 | G-2 |
(cm.) | 2.7b* | 3.5a | 3.4a | 2.7b | 3.6a | 3.2a |
Altura de la planta | ||||||
(cm.) | 23b | 30a | 23b | 18.1c | 25.2b | 19.0c |
Número de nódulos/planta | 27b | 40a | 23b | 19c | 38a | 12c |
Peso seco de raíz (g.) | 4.3b | 4.9b | 5.4a | 4.3b | 3.5c | 5.3a |
Peso seco del follaje (g.) | 6.0a | 5.3b | 4.2c | 5.0b | 4.0c | 3.9c |
Peso seco de nódulos | ||||||
(mg.) | 520b | 539a | 120c | 516b | 534a | 109c |
*Letras iguales sin diferencia estadística significativa (0<0.5) según Tukey. n=20,
En el cuadro 3 se muestra que los mutantes de R. etli resistentes a diazinón, produjeron un número similar de colonias en AELMRC sin el pesticida, en donde no se registró diferencia entre R. etli silvestre y su mutante resistente a diazinón, lo cual apoya la factibilidad de seleccionar Rhizobium a este tipo de pesticidas (Smith et al., 2000).
Cuadro No. 3 Estabilidad de resistencia de Rhizobium etli a diazinón
Aislado (clave) | AELMRC con diazinón | AELMRC sin diazinón |
C-6 | 28c | 31c |
R-1 | 32c | 39c |
G-2 | 49b | 61a |
Unidades formadoras de colonias x102/ml *AELMRC=Agar extracto levadura manitol rojo congo. *Letras iguales sin diferencia significativa (<0.05) según Tukey.
En el cuadro No. 4 se muestra que R. etli fue tolerante a diazinón por su capacidad de adaptación fisiológica al pesticida, lo que prueba que esta resistencia de Rhizobium a diazinón, puede ser usada para registrar su comportamiento en el campo, en zonas agrícolas donde las leguminosas tienen problema con los insectos-plagas de raíz y ello limita su producción (Alexander, 1977; Das y Mukherjee, 2000).
Cuadro No. 4 Utilización de diazinón como única fuente de carbono por Rhizobium etli.
Aislados | AELRC sin | AELRC con | AELMRC con | AELMRC sin |
(clave) | diazinón | Diazinón | manitol y | manitol ni |
diazinón | diazinón | |||
C-6 | 33c | 30c | 10d | 1 |
R-1 | 40b | 37c | 8d | 0 |
G-2 | 59a | 50a | 13d | 2 |
UFC (Unidades formadoras de colonias/ml). * Letras iguales sin diferencia estadística significativa. (<0.05) Según Tukey. * AELMRC.
Estos resultados muestran que el diazinón no se usó como fuente de carbono, pero si se coometabolizo, pues al suprimir el manitol y agregar solo diazinón, el crecimiento de R. etli se inhibió. Además se encontró que los mutantes de R. etli fueron resistentes a diazinón, malathión y servin; pesticidas aplicados en fríjol, para protegerlos del ataque de insectos plaga y que no afectan su capacidad infectiva y efectiva para FBN.
La concentración máxima a la cual la bacteria fue resistente a los pesticidas, fue mayor a la aplica en el campo, por lo que el tipo de R. etli mutante es posible usarlo como inoculante en la producción de fríjol sin ningún problema (Das y Mukherjee, 2000; Kantachote, et al 2001).
Los resultados obtenidos indican que es posible diseñar un medio de cultivo selectivo, con diazinón, para recuperar R. etli de un suelo agrícola no esteríl. Esto indica que es factible resolver el problema de la aplicación de inoculantes a base de Rhizobium etli con el uso obligado de pesticidas en sitios, en donde aún no se aplica otra forma biológica de combatir insectos-plaga.
Agradecimientos
Al Proyecto 2.7 (2005-2006) de la CIC-UMSNH por el apoyo a esta publicación, a Jeanneth Caicedo Rengifo por la escritura.
1.- Alexander, M. 1971. Biochemical ecology of microorganisms. Ann. Rev. Microbiol 25:361-392
2.- Alexander, M. 1977. Introducción a la microbiología del suelo. AGT Ed. pp:463-481.
3.- Claridge, C.A. and Schmitz, H. 1978. Microvial and chemical transformations of some 12,13-Epoxytrichotec. App. Environ. Microbiol. 36:63-67
4.- Ferguson, J. and Korte, K. 1977. Epoxidation of aldrin to exo aldrin by soil bacteria. Appl. Environ. Microbiol 34:7-13.
5.- Ruplal R. and Saxena, D.M., 1982. Accumulation metabolism and effects of organochlorine insecticides on microorganisms. Microbiol. Rev. 46:95-127.
6.- Das A.C. and Mukherjee D. 2000. Soil application of insecticides influences microorganisms and plant nutrients. Appl Soil Ecology 14:55-62.
7.-Kantachote D., Naidu, R., Singleton I., McClure N. and Harch. B. D.. 2001. Resistance of microbial populations in DDT-contaminated and uncontaminated soils. 16:85-90.
8.- Smith M. D, Hartnett D.C. and Rice C.W. 2000. Effects of long-term fungicide applications on microbial properties in tallgras prairie soil. Soil Biol. Biochem. 32:935-946.
9.- Sommerville L., Greaves, M.P., 1987. Pesticide Effects on the Soil Microflora. Taylor and Francis, London pp:240.
10.- Vincent, JM. 1975. Manual practico de Rhizobiología. Ed Hemisferio Sur. Argentina.
De Luna E, Gustavo*.,
Peña-Cabriales, Juan Jose **
Sánchez-Yáñez, Juan Manuel. ***
*Microbiología Industrial y del Suelo. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Autónoma de Nuevo León, Monterrey, N.L. México. Apdo. Postal 414, San Nicolás de los Garza. N. L, México, CP 64000. ** Microbiología Ambiental. CINVESTAV-IPN. Unidad-Irapuato, Irapuato, Gto. México. ***Microbiología Ambiental. Ed. B-1. C.U. Instituto de Investigaciones Químico Biológicas. Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo
autor correspondiente,
Morelia, Mich. CP 58030. México.