Secreción pulsátil diurna de la hormona foliculo estimulante (FSH) en ovejas prepúberes con y sin restriccion alimenticia (página 2)

4. Material y metodos

Manejo general de las ovejas prepúberes. Se utilizaron 10 borregas de raza Suffolk provenientes de la Unidad de Producción Ovina de la Facultad de Agronomía de la Universidad de Concepción, nacidas a fines de agosto y destetadas a los 3 meses de edad. A su llegada a la Facultad de Medicina Veterinaria se alimentaron con pradera y alimento concentrado peletizado (Novillina Champion®). A las 20 semanas de edad, las borregas se separaron al azar en 2 grupos: un grupo control y uno experimental. Con el fin de controlar la alimentación, las borregas se mantuvieron estabuladas y recibieron solo alimento concentrado. Las borregas del grupo control (n=5) recibieron alimento a voluntad, mientras que las borregas del grupo experimental (n=5) recibieron alimento concentrado en cantidad equivalente al 2% del peso corporal. Ambos grupos recibieron dos raciones al día. Con este esquema de alimentación se buscó mantener el peso en las borregas del grupo experimental durante el período de restricción alimenticia. Tres días antes de los estudios de pulsatilidad de FSH, las borregas se trasladaron a la sala de experimentación, donde se colocaron en bretes individuales, manteniéndose el régimen de alimentación y con libre acceso a agua. Las borregas se cateterizaron en la vena yugular de acuerdo al procedimiento descrito por Recabarren y col. (1995). Se procedió a realizar muestreos sanguíneos de acostumbramiento siguiendo el mismo protocolo del estudio de pulsatilidad por una hora, dos veces al día, el día anterior al inicio del experimento, con el fin de minimizar los riesgos de estrés.

Estudio de pulsatilidad de FSH. El estudio de pulsatilidad de FSH consistió en la colección de muestras de sangre (3 mL) por medio del catéter yugular implantado previamente, a intervalos de 10 minutos por un período de 5 horas (10:00- 15:00 horas) a las 20, 26 y 30 semanas de edad, después de 0. 6 y 10 semanas de restricción alimenticia del grupo experimental. Las muestras de sangre se depositaron en tubos heparinizados (10 UI de heparina/mL de sangre), se centrifugaron a 1000 x g, por 15 minutos, el plasma se separó y se congeló a –20°C, hasta el posterior análisis de las concentraciones plasmáticas de FSH por radioinmunoensayo (RIA).

Radioinmunoensayo de FSH. El radioimmunoensayo de FSH se realizó con materiales provenientes de la NIADDK (USA) siguiendo el protocolo indicado con los materiales. Brevemente, se incubaron 200 µl de FSH ovina standard (oFSHRP) en un rango de 0.02 a 25.6 ng/tubo o 200 µl de muestra desconocida, con 100 µL de FSH iodada (oFSH I-1 AFP 5679 C) y 100 µL de antisuero contra FSH ovina (AFP C 5228113) por 24 horas a temperatura ambiente. Luego, se agregaron 100 µL de segundo anticuerpo y se continuó la incubación por 48 horas. Posteriormente, los tubos se centrifugaron a 1000 x g por 40 min a 4º C, se descartó el sobrenadante y se cuantificó el pellet en un gammaespectrómetro LKB. La concentración mínina detectable correspondiente al 90% del buffer control fue de 0.2 ng/mL., con un coeficiente de variación intraensayo de 6% e interensayo de 10%.

Determinación de las características de la secreción pulsátil de FSH. Las concentraciones plasmáticas de FSH de cada oveja se analizaron en forma individual usando el programa computacional CLUSTER, desarrollado por Veldhuis y Johnson (1986). Este programa permite identificar, mediante un algoritmo reiterativo, las fluctuaciones hormonales definidas como pulsos en una serie consecutiva de muestras, utilizando como parámetro de identificación el coeficiente de variación del RIA, la frecuencia de muestreo, la forma definida del pulso asignada por el operador (usando 1 o más puntos para el "peak" y uno o más puntos para el nadir), y las diferencias estadísticas entre puntos. El programa además identifica la amplitud media de los pulsos, el intervalo entre pulsos, la duración de los pulsos y el nadir (promedio de las concentraciones plasmáticas entre los pulsos). Para la identificación de los pulsos de FSH se escogió una forma de pulso de 3×3 para definir el máximo y el mínimo respectivamente con un test de t de 2.75 (). Con este procedimiento las probabilidades de identificar un pulso falso positivo fue menor de 5%.

Análisis estadístico. Los parámetros de la secreción pulsátil de FSH: promedio transversal del período (ng/mL/5h), frecuencia de pulsos (número de pulsos/5h), amplitud de los pulsos (ng/mL) y nadir (ng/mL) presentes a las 20, 26 y 30 semanas se analizaron en un mismo grupo mediante análisis de varianza para muestras repetidas en un diseño de bloques, con comparación entre los promedios con el test de Newman Keuls utilizando el programa estadístico GB.Stat v.6. Los datos se muestran como promedio ± error estándar. Se consideró un P<0.05 como una diferencia estadísticamente significativa.

5. Resultados

En el cuadro 1 se entregan los resultados del estudio de pulsatilidad de FSH en las borregas controles y en las borregas con restricción alimenticia. El promedio transversal de la concentración de FSH (ng/mL/5h) aumentó cerca de un 50% entre las 20 y las 30 semanas de edad en el grupo de borregas controles (P>0.05). En cambio, en las borregas sometidas a restricción alimenticia se observó una tendencia a disminuir entre las 20 y las 30 semanas de edad, al cabo de 10 semanas de restricción. La concentración plasmática promedio de FSH (ng/mL/5h) en el grupo de borregas experimentales fue menor en más de un 50% en comparación con las concentraciones plasmáticas de FSH de las borregas controles (P>0.05).

Como se muestra en el cuadro 1, la frecuencia de los pulsos de FSH no presentó diferencias estadísticas entre las edades en un mismo grupo ni entre los grupos. La amplitud de los pulsos de FSH tendió a aumentar entre las 20 y 30 semanas de edad en el grupo control, con una disminución mayor de un 50% en las borregas con alimentación restringida entre las 20 y 30 semanas de edad (P>0.05). La amplitud de los pulsos tendió a ser menor en las borregas con restricción alimenticia que en el grupo control a las 30 semanas de edad (P=0.079), luego de 10 semanas de restricción alimenticia.

El nadir disminuyó en un 50% luego de 10 semanas de restricción alimenticia en las borregas con restricción alimenticia, pero sin significancia estadística entre las edades ni entre los dos grupos de borregas.

Con relación a los perfiles de las concentraciones plasmáticas de FSH de cada borrega, en las borregas controles, a las 30 semanas de edad, con excepción de una borrega, se observa que la secreción pulsátil de FSH se ha acentuado con respecto a las 20 y 26 semanas de edad (figura 1). Por el contrario, en las borregas con alimentación restringida, la pulsatilidad de la secreción de FSH está disminuida en comparación con las borregas controles de la misma edad (figura 2).

6. Discusion

Se ha postulado que la restricción alimenticia retrasa el inicio de la pubertad en borregas, lo cual se debería a una menor secreción de GnRH, asociada a una menor secreción de LH. El objetivo de este estudio fue reconocer si la restricción alimenticia podría influir también en la secreción de FSH, teniendo presente que la FSH así como la LH se secreta desde la hipófisis en respuesta a la GnRH.

Los resultados obtenidos en el presente estudio muestran que las concentraciones plasmáticas promedio, la frecuencia, la amplitud de los pulsos y el nadir de FSH tienden a aumentar entre las 20 y 30 semanas de edad en las borregas controles. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Padmanabhan y col. (1992), quienes encontraron que la concentración plasmática de FSH immunoreactiva de borregas prepúberes y púberes no presenta diferencias, aunque la FSH bioactiva aumenta. Estos autores demostraron también que en las hembras púberes hubo un aumento de la inhibina y del estradiol plasmático (Padmanabhan y col., 1992). En contraste con lo observado en las borregas controles, en las borregas con restricción alimenticia la concentración promedio y la amplitud de los pulsos de FSH tienden a disminuir entre las 20 y las 30 semanas de edad, luego de 10 semanas de restricción alimenticia, aunque sin cambios en la frecuencia de pulsos de FSH. Estos resultados concuerdan también con la demostración que la restricción proteica durante el desarrollo prepuberal de ovejas tampoco influye en la síntesis de FSH, pero sí lo hace sobre la síntesis de LH (Polkowska y col., 2003). Estos resultados sugieren que la restricción alimenticia tendría un efecto supresor parcial sobre la secreción de FSH, de tal forma que el retraso en el inicio de los ciclos estrales en borregas con restricción alimenticia sería consecuencia de otros mecanismos en los cuales no estaría comprometida la secreción de FSH, y si lo fuese, la FSH no sería un factor determinante en este fenómeno.

Los resultados del presente trabajo concuerdan con los descritos en un estudio realizado en vaquillas con restricción alimenticia. En este estudio se encontró que las vaquillas exhibieron menor secreción de LH como consecuencia de una disminución en la producción y secreción de GnRH, pero sin cambios en la secreción de FSH (Viscarra y col., 1997). Para estos investigadores, la FSH no es esencial en los eventos que conducen al inicio de la reproducción en la vaca, ya que sus concentraciones plasmáticas no se modificaron con la restricción alimenticia. Es posible entonces que en la borrega ocurra algo similar a lo descrito en vaquillas, ya que en un estudio complementario al presente trabajo, en el cual se midió la concentración plasmática de LH (Recabarren y col., 2001), se demostró que la restricción alimenticia postergó el inicio de la pubertad acompañada con una disminución significativa en la secreción de LH. Este concepto es respaldado por el hecho de que en las borregas controles hubo una tendencia a que la secreción de FSH aumentara entre las 20 y 30 semanas de edad. Por consiguiente, estos datos colectivamente sugieren que la secreción de LH es más decisiva en los eventos que anteceden a la pubertad, independiente del hecho de que ambas gonadotropinas dependen de la GnRH para su secreción. Una situación similar se ha reconocido en machos. En carneros Merino adultos castrados con sustitución de testosterona y de inhibina, alimentados a la mitad de una dieta de mantención, no mostraron diferencias en la secreción de FSH con respecto a machos alimentados con dieta de mantención (Tjondronegoro y col., 1996), resultados que confirman la hipótesis de que la nutrición ejerce escasa influencia sobre la secreción de FSH.

De acuerdo a los estudios de Wildt y col. (1981), la frecuencia de pulsos de GnRH determina el tipo de gonadotropina que secreta la hipófisis. Altas frecuencias de pulsos de GnRH favorecen la secreción de LH y reducen la secreción de FSH, mientras que bajas frecuencias de pulsos de GnRH disminuyen la secreción de LH, pero facilitan la secreción de FSH. En el presente estudio, es posible suponer que la restricción alimenticia disminuyó la secreción pulsátil de GnRH. Esto es posible deducirlo por medio del análisis de las características de la secreción pulsátil de LH, ya que hay una estrecha asociación entre la secreción de GnRH y LH. Sin embargo, en el estudio paralelo a éste y que se ocupó del análisis de la secreción de LH (e indirectamente de la secreción de GnRH por la estrecha dependencia entre ambas hormonas) en borregas con restricción alimenticia, no se observaron cambios en la frecuencia de pulsos de LH, por lo que se puede asumir que la frecuencia de pulsos de GnRH no se modificó, pero sí hubo una disminución significativa en la concentración plasmática de LH y en la amplitud de los pulsos. Esto podría explicar en parte la parcialidad del efecto de la restricción alimenticia sobre la secreción de FSH, ya que si hubiese habido una disminución en la frecuencia de los pulsos de GnRH, debería haber aumentado la secreción de FSH. Es posible entonces suponer que la restricción alimenticia podría estar influyendo en la secreción de FSH mediante otros mecanismos no dependientes de la GnRH.

Otros importantes reguladores de la secreción de FSH en hembras son las inhibinas, activinas y foliculostatinas (Welt, 2002). Se desconoce si en la oveja prepúber la restricción alimenticia podría influir en la secreción de inhibina, o en la concentración de activinas o en la actividad de la foliculostatina lo que podría explicar la disminución en las concentraciones plasmáticas de FSH. Se ha demostrado que ovejas Merino delgadas tienen mayor cantidad de inhibina en los ovarios que ovejas obesas (Boukhliq y col., 1996), por lo que se podría especular que las borregas con bajo peso corporal, producto de la restricción alimenticia, podrían sintetizar y secretar mayores cantidades de inhibina que las borregas con crecimiento normal y contribuir al control de la secreción de FSH. En carneros, alimentados con la mitad de la dieta de mantención, la administración de líquido folicular bovino disminuyó en mayor proporción la FSH plasmática que en carneros alimentados con el doble de la dieta de mantención (Tjondronegoro y col., 1996), lo que sugeriría que los carneros sub-alimentados serían más sensibles al efecto inhibidor de la inhibina. Sin embargo, el efecto de la sub-alimentación sobre la producción de inhibina en borregas tampoco sería muy destacable, de lo contrario se debería haber observado una importante disminución de la secreción de FSH al sumarse los efectos hipotalámicos y los de origen ovárico sobre la secreción de FSH.

En resumen, las concentraciones plasmáticas de FSH no aumentan significativamente entre las 20 y 30 semanas de edad en borregas con un régimen de alimentación normal, mientras que en borregas con restricción alimenticia la FSH plasmática tiende a disminuir. Los resultados sugieren que la restricción alimenticia tendría un efecto supresor parcial sobre la secreción de FSH, de tal forma que el retraso en el inicio de los ciclos estrales en borregas con restricción alimenticia sería consecuencia de otros mecanismos en los cuales no estaría comprometida la secreción de FSH, o si lo fuese, la FSH no sería un determinante en este fenómeno.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la NIADDK y al Dr A. Parlow por su generosa entrega de reactivos para el RIA de FSH. Al Dr José Cox por facilitarnos la sala de experimentación.

7. Referencias

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S. E. RECABARREN, Biol., M.Sc.; A. LOBOS, M.V., Mg.S.; O. POBLETE, M.V.; P. MUÑOZ, J. PARILO, Ing. Agr. Laboratorio de Fisiología y Endocrinología Animal, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Concepción, Campus Chillán –