Efecto de la heparina en la capacidad fecundante in vitro de espermatozoides caprinos

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RESUMEN: El presente estudio está destinado a establecer la etapa del proceso de fecundación en que la heparina ejerce el efecto estimulatorio de la fecundación en caprinos.

Oocitos bovinos fueron madurados en medio 199 y alternativamente utilizados para la producción de zonas pelúcidas solubilizadas o para estudios de fecundación. Las zonas pelúcidas, colectadas eliminando mecánicamente al oocito, fueron solubilizadas en ácido acético, liofilizadas y almacenadas a -20° C, hasta su reconstitución. Los espermatozoides fueron colectados con vagina artificial, lavados y capacitados por incubación en medio Talp con suero y heparina.

En el Experimento 1, los espermatozoides fueron suspendidos en Talp más heparina, Talp más heparina y zonas pelúcidas o en condiciones no capacitantes y fueron incubados por 90 min a 39° C y 5% de CO2 en aire. En el Experimento 2, los espermatozoides agrupados como en el experimento anterior fueron coincubados por 18 h con oocitos. En el Experimento 3, los espermatozoides fueron suspendidos en plasma seminal y Talp con y sin heparina e incubados por 90 min a los 0, 45 y 90 min, muestras de suspensión fueron expuestas a zonas solubilizadas e incubadas por otros 30 min. En los experimentos 1 y 3, el daño acrosomal fue evaluado usando la tinción PI/PSA y en el Experimento 2, la fecundación fue verificada por la presencia de pronúcleos y cola espermática en el oocito.

Los resultados en el Experimento 1 muestran que a los 90 min de incubación el daño acrosomal aumenta en los espermios tratados con zonas en relación a los controles (P< 0.001). En el Experimento 2. sólo hubo fecundación en los grupos espermáticos incubados en condiciones capacitantes. En el Experimento 3, los resultados muestran que el daño acrosomal aumenta ya a los 45 min de incubación (P<0.01).

Palabras claves: heparina, capacitación espermática, caprinos.

SUMMARY: Effect of heparin on the in vitro fertilizing ability of goat spermatozoa as assessed by heterologous solubilized zona pellucidae.

Heparin has been shown to improve the fertilizing ability of goat spermatozoa in a dose-dependent manner. The present study assessed the mechanism involved in the stimulatory effect by using solubilized zona pellucidae from bovines.

Bovine cumulus-oocyte complexes were matured in 199 plus serum and insuline. Thereafter, oocytes were denuded from granulosa cells and used either to obtain zona pellucidae or for fertilization. Free zonae were collected by mechanical means, solubilized in heated acetic acid, liofilized and stored at -20° C until their reconstitution in Talp plus serum.

In Experiment 1, spermatozoa were suspended either in non-capacitated conditions or in Talp plus heparin and Talp plus heparin and zonae, and incubated for 90 min at 39° C in 5% CO2 in air. In Experiment 2, spermatozoa were grouped as before and co-incubated with matured oocytes for 18 hr to assess their fertilizing ability. In Experiment 3, spermatozoa were suspended either in seminal plasma, Talp plus heparin or Talp without heparin for 90 min. At 0, 45 and 90 min, semen samples were exposed to solubilized zonae and were further incubated for 30 min. Acrosome disruption in Experiment 1 and 3 was assessed by staining spermatozoa with PI/PSA. Fertilization in Experiment 2 was verified by the presence of pronuclei and sperm tail.

The results in Experiment 1 showed that the acrosome disruption rate increased above the control groups after 90 min of incubation only in zonae-treated spermatozoa (P<0.001). In Experiment 2, fertilization was seen only when spermatozoa were previously incubated in conditions known to capacitate them. In Experiment 3, the results showed that the acrosome disruption rate first increased when spermatozoa were exposed to zonae after 45 min of incubation (P<0.01).

The cumulative results suggest that heparin improves fertilization by stimulating sperm capacitation. The effect is expressed after 45 min of sperm incubation.

Key words: heparin, sperm capacitation, goats.

INTRODUCCION

La heparina ha demostrado mejorar la capacidad fecundante in vitro de espermatozoides de bovinos (Parrish y col., 1989), ovinos (Cox y col., 1992) y caprinos (Cox y col., 1995). En bovinos, la heparina facilita la capacitación espermática de espermatozoides eyaculados, uniéndose a residuos sulfatos (Miller y Ax, 1989) y probablemente removiendo factores decapacitantes adheridos a la membrana plasmática, tales como proteínas fijadoras de calmodulina (Leclerc y col., 1992; Therien y col., 1995).

Para demostrar el efecto de la heparina en la capacitación espermática en bovinos, Parrish y col., (1989) utilizaron lisofosfatidilcolina, un lípido fusogénico capaz de desencadenar la reacción de acrosoma sólo en espermios capacitados. Más recientemente, Florman y col. (Florman y First, 1988; Florman y col., 1990) utilizaron zonas pelúcidas solubilizadas para evaluar el estado funcional de espermatozoides de bovinos. La solubilización de las zonas pelúcidas permite la liberación a la solución de ZP3, glicoproteína estructural de la zona pelúcida, responsable de la fijación espermática y de la inducción de la reacción de acrosoma a nivel de la zona pelúcida (Wassarman, 1987). Como sólo los espermios capacitados son capaces de ligar ZP3, la adición de zonas pelúcidas solubilizadas a preparaciones espermáticas en asociación con una evaluación de la integridad acrosomal, constituye un modelo útil para la identificación fisiólogica del estado funcional de los espermatozoides.

En caprinos, la heparina aumenta la capacidad fecundante in vitro de los espermatozoides, siguiendo un patrón dosis-respuesta que se asemeja para los distintos machos (Cox y col., 1995). En el mismo estudio se mostró que el efecto en la capacidad fecundante toma un tiempo mínimo que se aproxima a una hora y que la eficiencia es influida por la actividad biológica de la heparina. El objetivo del presente trabajo fue precisar el efecto de la heparina en la función fecundante de los espermatozoides caprinos.