Contenido de glicosaminoglicanos, aldehídos y proteínas en el líquido sinovial de la articulación metacarpofalángica equina normal y alterada (página 2)

MATERIAL Y MÉTODOS

Se utilizó líquido sinovial obtenido por artrocéntesis (Byars y col 1982), desde la articulación metacarpofalángica de equinos mestizos mayores de tres años, según cronometría dentaria y recién beneficiados en el matadero "La Pintana" (Región Metropolitana). Se clasificaron 17 muestras como normales y 45 como patológicas, de acuerdo al aspecto macroscópico de la articulación. Se clasificaron como normales aquellos líquidos sinoviales obtenidos de articulaciones cuyo cartílago era de color blanco nacarado, con su superficie lisa y brillante, sin líneas de roce o zonas de erosión. Además, la membrana sinovial no debía presentar signos de congestión, mientras que el líquido sinovial debía ser de color amarillo claro, transparente, sin flóculos ni trazas de material sanguinolento (González y col 1994, Adarmes y col 2003).

A su vez, las muestras patológicas se dividieron en tres grupos (+, ++, +++) según la magnitud de las lesiones. Así, una cruz (+) (n = 15) correspondió a aquellas articulaciones cuyos cartílagos presentaban cambios leves de color con líneas de roce. Dos cruces (++) (n = 12) correspondió a francos cambios de coloración del cartílago articular, con líneas de roce manifiestas y pequeños focos de erosión. Tres cruces (+++) (n = 18) correspondió a alteraciones del cartílago en su grado máximo, con grandes focos de erosión (González y col 1994). El líquido sinovial obtenido se mantuvo en hielo y luego se realizó su procesamiento en el laboratorio, para lo cual se centrifugó a 950 x g durante 20 minutos a 4 °C. Los sobrenadantes se congelaron a –20 °C, para realizar luego las siguientes determinaciones, previa dilución 1:4 de estas muestras de líquido sinovial.

En la determinación de proteínas (Lowry y col 1951) se utilizó seroalbúmina de bovino al 0,1%, a partir de la cual se preparó una curva estándar con un rango de cantidad de proteína entre 50 y 500 µg, estableciéndose la absorbancia espectrofotométricamente a 595 nm. Los resultados se expresaron como g de proteína/L de líquido sinovial.

Para la determinación de grupos aldehídos asociados al colágeno, se utilizó el método descrito por Sawiki y col (1961), modificado por Paz y col (1965) y adaptado por Horwath y Tabora (1972). A partir de una solución de acetaldehído 10-3 M se preparó una curva estándar en un rango de cantidad de acetaldehído entre 2,0 y 8,8 µg. La absorbancia se determinó espectrofotométricamente a 670 nm, expresándose los resultados como g de aldehídos/L de líquido sinovial. Esta técnica consiste en la formación de un complejo coloreado, por la reacción de los aldehídos alifáticos con el N-Metil Benzotiazolidon Hidrazona (MBTH) al 1% en presencia de FeCl3 al 0,2%. Para esto se utilizaron 0,8 ml de una solución diluida (1:4) de líquido sinovial y 0,2 ml de MBTH al 1%. Después de 30 minutos a temperatura ambiente se agregaron 2,5 ml de FeCl3 al 0,2% y 6,5 ml de acetona. Para determinar la concentración de GAGs totales (GAGs T) y de GAGs diferentes del ácido hialurónico (GAGs S) se utilizó el método colorimétrico de Bartold y Page (1985) descrito por Adarmes y col (2003).

Finalmente se realizó la estimación del contenido de ácido hialurónico al calcular la diferencia entre GAGs T y GAGs S.

Análisis estadístico. Mediante la prueba de Kolmogorov- Smirnov se estableció que los datos experimentales no difieren significativamente de una distribución normal. Los valores experimentales de cada grupo se sometieron a un análisis de varianza y luego se realizó la prueba de Duncan con el fin de establecer las diferencias entre grupos homogéneos (Zar 1996) utilizando un programa Computacional Statistica 6.0. Se consideró un nivel de significancia de P < 0,05. Los valores obtenidos se expresan como media ± DE para cada variable analizada.

RESULTADOS

La concentración de proteínas totales del líquido sinovial refleja los procesos de ultrafiltración del plasma sanguíneo en la membrana sinovial y el recambio molecular de las estructuras articulares. Los resultados indican que la concentración de proteínas fue significativamente mayor (P < 0.05) sólo en el grupo con daño más severo (+++) (cuadro 1).

La concentración de residuos aldehídicos en el líquido sinovial (cuadro 2) que representan los productos de degradación del colágeno mostró un incremento significativo en el grupo menos alterado (+) con respecto al más alterado (+++) (P < 0,05). Con la finalidad de establecer la proporción de proteína colagenosa en el líquido sinovial, se calculó la relación aldehídos/proteínas, encontrándose que ésta disminuyó en forma significativa (P < 0,05) en el grupo más alterado (+++) con respecto a los grupos menos alterados (+ y ++).

La concentración de GAGs T y de GAGs S en el líquido sinovial no mostró variaciones significativas entre los grupos analizados (P > 0,05), observándose en el caso de los GAGs T una tendencia a disminuir en el grupo más alterado (+++) comparado con el normal, mientras que los GAGs S muestran una tendencia a aumentar en el grupo más alterado (+++) (cuadro 3). Con respecto al contenido de ácido hialurónico del líquido sinovial, tampoco se encontraron variaciones significativas entre los grupos analizados (P > 0,05), observándose sólo una tendencia a disminuir (P < 0,08) en el grupo con mayor daño articular comparada con el grupo normal.

DISCUSIÓN

Para la obtención de un diagnóstico precoz de la alteración del cartílago articular se ha buscado detectar y/o medir la concentración de moléculas propias de la MEC del cartílago articular, en diferentes líquidos biológicos que incluyen el fluido sinovial (Maldonado y col 1983, Thonar y col 1985; Little y col 1990; Alwan y col 1991; Fuller y col 1996; Todhunter y col 1997; Okumura y Fujinaga, 1998; Frisbie y col 1999). Se evaluó en el líquido sinovial de la articulación metacarpofalángica equina con distintos grados de alteración el contenido del conjunto de componentes orgánicos más abundantes de la MEC del cartílago, como son el colágeno y los GAGsS.

La concentración de proteínas del líquido sinovial no constituye sólo un reflejo de la degradación de la MEC, sino que también del proceso de ultrafiltración a nivel de la membrana sinovial y la razón de medir su concentración se relacionó con el alto contenido de proteína colagenosa de la MEC, que es aproximadamente dos tercios el peso seco del cartílago articular adulto (Eyre 2002) y con la finalidad de utilizar este parámetro para determinar la proteína colagenosa a través de la relación de aldehídos/proteínas totales. Esta concentración se encontró aumentada significativamente (P < 0,05) en el grupo más alterado, lo que concuerda con lo descrito por Tew (1982). Este incremento podría reflejar una mayor degradación de los componentes de la MEC del cartílago por acción de diversas metaloproteinasas, o bien, una alteración en la capacidad de ultrafiltración de la membrana sinovial, aunque esta alteración se asocia especialmente a los procesos de naturaleza inflamatoria aguda (Tew 1980).

El desbalance entre la síntesis y degradación del colágeno, así como el incremento de la actividad de las colagenasas (Squires y col 2003), se relaciona con alteraciones del colágeno del cartílago articular, lo que constituye un evento central en la patogénesis del envejecimiento del cartílago y de la enfermedad degenerativa articular (Tiku y col 2003).

La concentración de grupos aldehídos representativos de los productos de degradación del colágeno del cartílago aumentó significativamente en el grupo menos dañado (+) respecto del más dañado (+++). Con el objetivo de relacionar el contenido de aldehídos con el carácter colagenoso de la proteína, se estableció la relación aldehídos/proteínas, la que también demostró una disminución significativa (P < 0,05) del componente colagenoso del líquido sinovial, a medida que el daño se hace más severo, al compararlo con los grupos con daño leve (+) y moderado (++). Esto se podría asociar a la mayor degradación de colágeno en los procesos iniciales, debido a la liberación de mediadores de la inflamación desde la membrana sinovial, con activación de MMPs que afecten la superficie del cartílago y a la presencia de colágeno menos entrelazado en esa zona. Por otro lado, los procesos articulares degenerativos aumentan con la edad, factor que también influye en el incremento de la cantidad de entrelazos del colágeno del tipo de la hidroxilisilpiridinolina y lisilpiridinolina (Ricard- Blum y Ville 1989), o bien del tipo de la pentosidina (Brama y col 1999), menos degradables por acción enzimática, lo que podría explicar la menor cantidad de proteína colagenosa en el líquido sinovial del grupo más alterado.

En este resultado se debe considerar también la metodología utilizada, por cuanto la reacción del MBTH permite el reconocimiento de grupos aldehídos, que se asocian posiblemente a productos de degradación de colágeno menos entrelazados, y por el contrario, al aumentar la madurez del colágeno con la formación de entrelazos más irreversibles, los grupos aldehídos podrían encontrarse menos disponibles para la reacción con el MBTH.

Por otro lado, los GAGs T, los GAGs S y el ácido hialurónico no mostraron cambios significativos entre los grupos analizados, detectándose una tendencia a disminuir del ácido hialurónico en el grupo más alterado (+++), lo que también ha sido descrito por otros autores (Tulamo y col 1996) y que predispondría a incrementar aún más el daño mecánico del cartílago articular.

Además, la concentración de GAGs S representativos de la MEC del cartílago aumentó en forma no significativa en los tres grupos alterados, siendo esta tendencia mayor en el grupo más alterado (+++), lo que podría sugerir que a medida que aumenta el daño del cartílago, se produce mayor degradación de los proteoglicanos de la MEC del cartílago por acción de metaloproteinasas del tipo de la estromelisina o MMP-3 (Brama y col 2000) o bien se produce la síntesis de moléculas de proteoglicanos que no logran formar parte de MEC del cartílago, con la pérdida consecuente de los GAGs S hacia el líquido sinovial.

Estos resultados podrían indicar la pérdida asincrónica de los componentes colágeno y GAGs de la MEC del cartílago articular en que la pérdida inicial de la red de colágeno predispondría a la degradación posterior de los proteoglicanos, lo que se puede asociar a una activación diferenciada de las cascadas enzimáticas relacionadas con el proceso degradativo.

Se puede concluir que: la concentración de proteínas del líquido sinovial de la articulación metacarpofalángica equina fue mayor en el grupo con osteoartritis severa (+++). La concentración de grupos aldehído del líquido sinovial de la articulación metacarpofalángica equina, representativos de productos de degradación del colágeno, se encontró aumentada en la osteoartritis leve (+), mientras que el carácter colagenoso de la proteína del líquido sinovial fue mayor en la osteoartritis leve (+) y moderada (++). La concentración de GAGs T, de GAGs S y de ácido hialurónico no mostró cambios significativos entre los grupos analizados; sólo la concentración de ácido hialurónico mostró una tendencia a disminuir en el grupo con osteoartritis severa (+++).

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H Adarmes1*, A Croxatto1, M Galleguillos1, E González11 Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Universidad de Chile, Santa Rosa 11735 La Pintana, Santiago, Chile. # Proyecto DTI – A – 3135/1992. Universidad de Chile. * Fax 6785526, casilla 2 correo 15, Santiago.