Análogo de GnRH disminuye la secreción de hormona folículo estimulante (FSH) en ovejas prepúberes (página 2)

Estudio de pulsatilidad de FSH. El estudio de pulsatilidad de FSH se realizó a las 20 (previo a la primera aplicación del análogo), 26 y 30 semanas de edad. Para ello se colectaron muestras de sangre (1 ml), a través del catéter yugular implantado anteriormente, a intervalos de 10 minutos por un período de 5 horas (10:00-15:00 horas).

Procesamiento de las muestras de sangre. Las muestras de sangre se depositaron en tubos heparinizados (10 UI de heparina/1 ml de sangre), posteriormente se centrifugaron a 1.000 x g durante 15 minutos. El plasma se separó y se congeló a –20°C, hasta el posterior análisis de las concentraciones plasmáticas de FSH por radioinmunoensayo (RIA).

Radioinmunoensayo de FSH. El RIA de FSH se realizó con materiales donados por la NIADDK (USA) siguiendo el protocolo sugerido por A. F. Parlow de acuerdo a lo descrito anteriormente (Recabarren y col 2003). Brevemente, se incubaron 200 µl de FSH ovina estándar (oFSHRP) en un rango de 0,02 a 25,6 ng / tubo o 200 µl de muestra desconocida con 100 µl de FSH iodada (oFSH I-1 AFP 5679 C) y 100 µl de antisuero contra FSH ovina (AFP C 5228113) por 24 horas a temperatura ambiente. Luego se agregaron 100 µl de segundo antisuero y se continuó con la incubación por 48 horas. Posteriormente los tubos se centrifugaron a 1.000 x g por 40 minutos a 4°C, se eliminó el sobrenadante y se cuantificó la radioactividad del pellet en un gammaespectrómetro LKB. La concentración mínima detectable correspondiente al 90% del buffer control fue de 0,2 ng/ml. El coeficiente de variación intra e interensayo fue de 8 y 13%, con muestras controles en el rango de 1-2 ng/ml.

Determinación de las características de la secreción pulsátil de FSH. Las concentraciones plasmáticas de FSH de cada oveja se analizaron en forma individual, utilizando el programa computacional Cluster, desarrollado por Veldhuis y Johnson (1986), siguiendo el mismo procedimiento descrito en Recabarren y col (2003). Las siguientes variables se obtuvieron con el programa Cluster: promedio transversal (ng/mL/5h), frecuencia de pulsos (número de pulsos significativos/5h), amplitud de pulsos (ng/mL) y nadir (ng/mL).

Análisis estadístico. Los datos obtenidos del programa Cluster se evaluaron con análisis de varianza para muestras repetidas con el tratamiento como factor principal y las edades como el factor de repetición, utilizando el programa computacional GbStat v6.5. Los promedios se compararon con el test de Newman Keuls. Se consideró un p< 0,05 como estadísticamente significativo. Los datos se presentan como promedio ± error estándar.

RESULTADOS

En la figura 1 se muestran las características de la secreción pulsátil de FSH en borregas controles y en borregas tratadas con el análogo de GnRH. En las borregas controles, el promedio transversal (ng/mL/5h), la frecuencia (número de pulsos significativos/5h), la amplitud de los pulsos (ng/mL) y el nadir (ng/mL) no cambiaron con la edad. En las borregas tratadas con el análogo de GnRH, el promedio transversal de la concentración plasmática de FSH y la amplitud de pulsos disminuyeron significativamente entre el inicio del experimento y las 26 y las 30 semanas de edad (p<0,05), no así la frecuencia de pulsos. Al comparar entre ambos grupos, se observó que la concentración promedio de FSH fue menor en las borregas tratadas con el análogo de GnRH que en las controles de 26 y 30 semanas de edad: 2,42± 0,6 versus 0,34 ± 0,1 (p<0,05) y 3,81 ± 1,2 versus 0,36 ± 0,1 (p<0,05) respectivamente. La amplitud de pulsos de FSH fue menor en las borregas tratadas con el análogo de GnRH que en las controles de 26 y 30 semanas de edad: 4,79 ± 1,1 versus 0,38 ± 0,1 (p<0,05) y 6,38 ± 1,7 versus 0,48 ± 0,1 (p<0,05) respectivamente. Individualmente, se reconoció que en una de cinco borregas tratadas con el análogo de GnRH, las concentraciones plasmáticas de FSH estuvieron por debajo el nivel de sensibilidad del RIA, y se le asignó ese valor con fines estadísticos. A las 30 semanas solo 1 borrega presenta dos "mini-pulsos" de FSH en 5 horas. En la figura 2 se muestran los perfiles individuales de dos borregas representativas de ambos grupos. Con la excepción de una borrega del grupo control (borrega número 20), las concentraciones plasmáticas de FSH siguen un perfil irregular y sin una forma definida. En la figura 3 se muestra el promedio ± error estándar de ambos grupos de borregas. En ambas figuras es claramente discernible el efecto del análogo de GnRH en la supresión de la secreción de FSH.

DISCUSIÓN

Los resultados del presente trabajo muestran que la secreción de FSH no se modifica entre las 20 y 30 semanas de edad en las borregas controles, período del desarrollo sexual de la oveja que se considera prepuberal. Por el contrario, en las borregas tratadas con el agonista de GnRH, la secreción de FSH se redujo significativamente, sugiriendo la dependencia entre la secreción de FSH y la estimulación con GnRH. Los resultados obtenidos en las borregas controles coinciden con aquellos obtenidos de otro estudio realizado en nuestro laboratorio, en el cual se comparó la secreción de FSH entre borregas controles y borregas sometidas a restricción alimenticia (Recabarren y col 2003), y con los de Padmanabhan y col (1992), en los cuales no se observó un aumento significativo en la secreción pulsátil de FSH durante el período prepuberal en borregas con crecimiento normal. Estos resultados sugieren que la FSH tendría un rol secundario en el inicio de la pubertad de la oveja. Sin embargo, la demostración de varias isoformas de FSH ha llevado a postular que la FSH bioactiva sería un factor determinante en los eventos endocrinos que anteceden a la pubertad y que la FSH inmunorreactiva no sería un buen indicador de los cambios conducentes a la pubertad. McNatty y col (1998) compararon las concentraciones de FSH inmunorreactiva (medida por RIA) de aquella bioactiva desde el nacimiento al año de vida en ovejas, encontrando que en las hembras ovinas prepúberes la relación B/I de FSH se acerca a uno hasta la fecha promedio de inicio de la pubertad, pero que después la FSH inmunorreactiva desciende hasta el límite del ensayo, lo cual sugiere que la FSH bioactiva tampoco es un factor determinante en el inicio de la pubertad en la oveja.

Este estudio permite respaldar experimentalmente el uso del análogo agonista de GnRH Decapeptyl como una valiosa herramienta en estudios de la secreción de LH y FSH en ovinos, ya que su acción bloqueadora en la secreción de LH se ha demostrado en trabajos anteriores (Recabarren y col 2002), así como en otros animales de experimentación (Recabarren y col 1991). La ventaja de este recurso farmacológico es la frecuencia de uso. Basta una inyección intramuscular cada cuatro semanas para mantener bloqueada la secreción de gonadotropinas. El uso de antagonistas de receptores de GnRH no parece ser eficaz en disminuir la secreción de FSH, al menos en ovejas adultas. La aplicación de un antagonista de receptores de GnRH tiene poco efecto sobre la secreción aguda de FSH, mientras que suprime rápidamente la secreción de LH, calculándose que toma alrededor de 11 días con administración diaria del antagonista por cuatro días en provocar la disminución en la secreción de FSH (Campbell y col 1998). En vacas la aplicación de un antagonista de GnRH (Antarelix) no modificó el promedio de las concentraciones plasmáticas ni la frecuencia de los pulsos de FSH (Schneider y col 2002), por lo que se podría esperar que el uso de antagonistas no entregue resultados concluyentes sobre la secreción de FSH en ovejas prepúberes. Más aún, el antagonista de GnRH no impidió que un pulso de GnRH exógena estimulara la secreción de LH. Basándose en este antecedente y para evitar el efecto estimulador inicial de la acción del agonista de GnRH, los estudios de pulsatilidad se efectuaron dos semanas más tarde de su aplicación. La base fisiológica del efecto de agonistas de GnRH en la supresión de la secreción de gonadotropinas estaría en la desensibilización del gonadotropo que sigue a una estimulación más potente que la obtenida con el neuropéptido endógeno y que comprende pérdida de receptores, y disminución de la síntesis de mRNA del receptor de GnRH (Wu y col 1994, Viscarra y col 1997, Horvath y col 2002) y bloqueo de la síntesis de las cadenas beta de la LH y FSH (Aspden y col 1996, Turzillo y col 1998). En ratas se ha demostrado que el Decapeptyl disminuye la expresión del gen para los receptores de GnRH in vivo (Lerrant y col 1995). Estudios similares con Decapeptyl no se han realizado en ovinos; sin embargo, la administración de leuprolide, un análogo agonista de la GnRH, disminuyó el mRNA del receptor de GnRH en hipófisis de ovejas (Wu y col 1994). La administración de Decapeptyl redujo en más de un 50% la concentración del mRNA de la cadena beta de la FSH y LH en ratas (Lerrant y col 1995), lo cual explicaría la disminución significativa en las concentraciones plasmáticas de FSH observada en el presente estudio.

El análisis de la secreción de FSH utilizando metodologías complejas como el muestreo directo de la sangre del seno cavernoso (Clarke y col 2002) o de la sangre portal que conduce a la hipófisis anterior (Padmanabhan y col 1997, 2003) en ovejas adultas ovariectomizadas muestra que la secreción de FSH es episódica y que algunos pulsos son sincrónicos con LH. En el estudio de Clarke y col (2002) un 13% de los pulsos son sincrónicos con los de LH, mientras que en el estudio de Padmanabhan y col (2003) se reconoció un 50% de concordancia. Estos resultados sugieren que un número variable de pulsos no depende de la secreción previa de GnRH y que otros mecanismos pueden dar cuenta de esta secreción no GnRH dependiente. En el presente estudio es difícil definir si cada pulso de FSH es la consecuencia de la secreción previa de un pulso de GnRH, ya que estos se presentan en forma irregular y aleatoria y sin un ritmo episódico, lo cual concuerda con resultados de Pincus y col (1998) en ovejas y mujeres. Este patrón de secreción es diferente del que presenta la hormona luteinizante y la GnRH con pulsos episódicos bien definidos. Sin embargo, el descenso significativo en las concentraciones promedio y en la amplitud de pulsos de FSH en las borregas tratadas con el agonista de GnRH sugiere fuertemente que la secreción de FSH es dependiente de GnRH.

En resumen, los resultados del presente estudio sugieren que la secreción de FSH es dependiente de la estimulación por GnRH en ovejas prepúberes.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Dr A. Parlow y a la NIADDK de Estados Unidos por su generosa donación de reactivos para el RIA de FSH de oveja.

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