Esterilización y desinfección (página 2)

Práctica en el Laboratorio.

En este Laboratorio se utilizaron materiales y métodos los cuales fueron aprendidos con éxito. Los materiales utilizados son los siguientes.

• Materiales de Vidrio:

• Tubos de Ensayo.
• Placas de petri.
• Pipetas Graduadas.
• Matraces de Erlenmeyer.
• Vasos de Precipitados.

• Otros Materiales:

• Mechero de Bunsen.
• Cestillo Metálico.
• Cementerio.

• Equipos:

• Autoclave.

Trabajo y Utilización de los Materiales en Laboratorio.

Preparación de medio Solidó (placas).

Para la realización de este proceso se realizo el siguiente trabajo.

• Se Preparo 50 ml. de agar nutritivo (25 ml. para cada placa) en un matraz de 250 ml. agregando con una probeta 50 ml. de agua destilada.
• La muestra Nutritiva de agar se preparo de la siguiente forma. Se pesaron 0.4 grs. en una balanza analítica luego a estos se le agregaron 50 ml. de agua destilada. Luego este medio de cultivo fue disuelto y se sometió al mechero hasta ebullición. Posteriormente a esta muestra se le coloco un tapón de algodón, este tapón de algodón fue envuelto en gasa para no desprender residuos de algodón y así no contaminar la muestra. Este tapón de algodón una vez puesto fue cubierto con papel de aluminio. Y esta muestra en conjunto con las placas de petri, las cuales envueltas en papel café fueron llevadas a autoclave. Tanto las placas de Petri como la muestra se le fue adherida una cinta distintiva la cual cumplía la función, una vez terminada la esterilización de identificar con un color mal esterilización, muy esterilizado y bien esterilizado. Los colores son: café, plateado y negro respectivamente.

Una vez terminado el proceso de esterilización en autoclave, en el cual fueron sometidas las muestras por un lapso de 15 minutos a una temperatura de 121°C. Estas fueron retiradas y llevadas al mesón en lo cual a orillas del mechero fueron destapadas y flameadas para luego verter el contenido en partes iguales en ambas placas. Este procedimiento fue realizado con éxito.

Estas placas con las muestras de cultivo esterilizadas fueron envueltas en papel café e identificadas para luego ser guardadas.

Preparación de medio Liquido.

Para la preparación de este medio se realizaron los siguientes procedimientos.

• Se dispuso de dos tubos de ensayo. En un matraz de 100 ml. se le agregaron 30 ml. de agua destilada, luego en una balanza analítica se pesaron 0.24 grs. del componente nutritivo, a este medio nutritivo o sea los 0.24 grs. se le agregaron a los 30 ml. de agua destilada, y así se procedió a disolver, para después con la ayuda de una pipeta graduada agregarle 10 ml. de caldo nutritivo a cada tubo. Posteriormente se realizo un tapón de algodón el cual se envolvió en gasa para evitar desprendimiento de restos de algodón y con esto no contaminar la muestra. En el siguiente paso se Procedió a taponar las muestras y envolver la parte superior de los tubos con papel de aluminio para luego llevarlos a autoclave.

RESULTADOS

Los resultados obtenidos en este laboratorio fueron optimos ya sea como en la parte de esterilización o como en la parte manipulación de instrumentos.

Se calcularon, se pesaron, se mezclaron y disolvieron los distintos productos, siguiendo los pasos descritos en la guía, se consiguió la Observación, y el aprendizaje deseado en este laboratorio.

Estos resultados fueron comprobados como positivos en cuanto a la esterilización ya que las etiquetas puestas en las muestras obtuvieron el color identificativo de esterilización, en este caso el negro.

En cuanto a los resultados de identificación de materiales también se obtuvo el objetivo, ya que por orientación y enseñanza de la profesora los materiales y equipos del laboratorio fueron nombrados uno a uno.

La parte manipulación de materiales fue supervisada y luego practicada por lo cual también se consiguió el aprendizaje.

En conclusión los resultados en líneas generales fueron positivos en su totalidad, solo descartando la posibilidad de que en los cultivos luego de haber sido retirados de autoclave y vertidos en las placas hayan sufrido algún tipo de contaminación.

Discusiones y conclusiones.

La importancia de este laboratorio no solo se basa en la observación y aprendizaje de la Esterilización, desinfección, manipulación e identificación de materiales, sino de comprender la importancia de los microorganismos y como influyen directamente en nuestras vidas. Los grandes hombres de ciencia que se aventuraron a descubrir este mundo oculto, nos proporcionaron todos sus descubrimientos, por los cuales dedicaron prácticamente toda su vida y que hoy con instrumentos y técnicas modernas podemos observar, practicar y realizar en los laboratorios.

Gracias a estas técnicas de esterilización e desinfección, tanto biólogos, como químicos y científicos en general han podido identificar, clasificar, para luego estudiar detalladamente, a la inmensa Variedad de microorganismos existentes en todos los lugares, Inimaginables que se puedan encontrar (desiertos, salares, casquetes polares, profundidades marinas, medios muy ácidos, aguas termales, etc.) Con esto han podido obtener en todos los campos, tanto económico, industrial, sobre todo de salud, resultados enormemente importantes para la humanidad. A medida que evolucionamos como especie, también los microorganismos lo hacen, y aunque seamos la especie dominante en este planeta, siempre estaremos ligados, o por no decir lo que es cierto, dependeremos de los microorganismos, los cuales forman parte importantísima de todos los sistemas vivos.

3  El conocimiento de la nutrición microbiana permite el cultivo de los Microorganismos en el laboratorio. Como acabamos de ver, en general, todos los Microorganismos tienen parecidos requerimientos de macro- y micro nutrientes, Aunque ha quedado claro que la forma en que cada nutriente es captado puede Variar mucho entre unas bacterias y otras, así como la cantidad relativa de cada nutriente. Los microbiólogos, en su trabajo cotidiano, están acostumbrados a manejar multitud de "recetas" o fórmulas correspondientes a muchos tipos de medios de cultivo.

Un medio de Cultivo es una solución acuosa (bien como tal, o bien incorporada a un coloide en estado de gel en la que están presentes todas las sustancias necesarias para el crecimiento de un(os) determinado(s) microorganismo(s). los medios de cultivo se pueden clasificar, en primera instancia, en tres grandes tipos:

1)

Medios complejos o indefinidos: su composición química exacta se desconoce, ya que son el Producto de realizar infusiones y extractos de materiales naturales complejos:

 Ejemplos:

	Digeridos crudos de extracto de carne
	Digeridos de extracto de levadura
	Digeridos de peptona de carne o de soja
	Digeridos de caseína (de la Leche).

Con ellos se logra un tipo de medio rico nutricionalmente, aunque indefinido químicamente. si lo que pretendemos simplemente es obtener un buen crecimiento bacteriano, este tipo de medios es ideal, ya que su confección es fácil y rápida (basta pesar una cierta cantidad del extracto desecado,

suministrado por casas comerciales, disolverlo en agua y esterilizar en autoclave, antes de inocular e incubar la bacteria con la que queramos trabajar). estos medios contienen fuentes variadas de c y n orgánicos, sales minerales y micro nutrientes. sin embargo, con ellos no podemos tener un control nutricional preciso, ya que desconocemos la composición química y proporción exacta de los distintos nutrientes.

2)

Medios sintéticos o definidos: se obtienen disolviendo en agua destilada cantidades concretas de distintas sustancias químicas puras, orgánicas y/o inorgánicas. la composición concreta de un medio sintético dependerá de la bacteria que queramos cultivar: lógicamente, un medio definido para una bacteria con grandes capacidades biosintéticas será más sencillo que el medio definido de otra bacteria con menores posibilidades biosintéticas. en la tabla siguiente se dan las composiciones de sendos medios sintéticos para dos bacterias diferentes

Como se puede deducir de la Tabla anterior, Escherichia coolí

Posee muchísimas capacidades biosintéticas, ya que puede crecer en un medio confeccionado exclusivamente a base de glucosa y sales minerales. (aún más impresionantes son las bacterias autótrofas, que ni siquiera requieren fuente orgánica de carbono, y se "apañan" con medios a base de sales solamente).

En cambio, Leuconostoc, a más de fuente orgánica de C y sales similares a las necesitadas por E. coolí, precisa una enorme diversidad de sustancias adicionales, incluyendo todos los aminoácidos proteinogenéticos, las bases nitrogenadas y un buen muestrario de vitaminas.

3)

En tercer lugar, podemos fabricar un tipo de medio "mezcla" de los anteriores, denominado medio semisintético: llevan algunas sustancias químicas cuya naturaleza y Cantidad conocemos, junto con sustancias de naturaleza y composición indefinidas.

Cualquiera que sea el tipo de medio, de los tres que acabamos de citar, podemos elaborar dos tipos de "versiones", según su estado aparente:

	medios líquidos (por ejemplo, los dos de la tabla)
	medios sólidos: derivan de los líquidos simplemente añadiendo a la solución nutritiva un coloide en estado de gel, que solidifica (da consistencia) a esta Solución.

En los primeros tiempos de la Bacteriología sólo se conocía como sustancia gelificante incorporable a los Medios la gelatina. Sin embargo, presenta muchos inconvenientes, ya que funde a 25oc (por encima de esta temperatura el medio se licua), y además, muchas bacterias presentan gelatinazas que hidrolizan la gelatina.

El gelificante más usado es el agar-agar, extraído de algas rojas (p. ej. gelidium), del cual existen versiones más o menos purificadas (las más puras están más enriquecidas en el polisacárido agarosa; son las que se emplean para los medios definidos, con objeto de evitar la introducción de sustancias "contaminantes" inadvertidas que falseen las interpretaciones sobre el comportamiento nutricional de la bacteria).

El agar presenta la gran ventaja de que una vez gelificado, no funde hasta cerca de los 100oC, lo que permite su uso para la inmensa mayoría de bacterias, que son mesó filas. Un comportamiento notable del agar es que una vez fundido (a 100ºC), no gelifica (solidifica) hasta los 45ºC. En este margen de temperatura hasta el límite de solidificación de 45ºC se dice que el agar está en sobrefusión.

Para cultivar ciertas bacterias (sobre todo los quimioautotrofos) se suele recurrir a un gelificante inorgánico, el silicagel o gel de Sílice.

Finalmente, introduciremos otra serie de conceptos relativos a medios de cultivo, que al igual que los anteriores, serán tratados con la suficiente amplitud en las sesiones de clases prácticas:

Medios selectivos

Son aquellos que permiten seleccionar un tipo (o unos pocos tipos) de Microorganismos. En el laboratorio se emplean mucho medios selectivos sólidos Que incorporan ciertas sustancias que inhiben el crecimiento de ciertas Bacterias, pero permiten el crecimiento de otras. (P. ej. medios que llevan violeta cristal inhiben el crecimiento de bacterias Gran-positivas.

Medios diferenciales son aquellos que permiten distinguir a simple vista dos o más tipos de bacterias en función de su distinto comportamiento respecto de algún nutriente del medio. Ese comportamiento Diferencial se traduce normalmente en un viraje de color de una sustancia Indicadora presente en el medio.

Ejemplos:

	en el medio EMB (eosina-azul de metileno) ciertos tipos metabólicos de bacterias producen cambios de color y precipitación de sales cuando producen ácidos por fermentación de ciertas fuentes de Carbono.
	El medio llamado agar-sangre lleva un 5% de sangre de caballo o carnero, lo cual revela la capacidad (y el tipo) de Hemólisis de ciertas bacterias.

Algunos medios son simultáneamente selectivos y Diferenciales.

P. ej., el agar de MacConkey, que el Alumno manejará en la segunda tanda de prácticas. Se trata de un medio de color rosado y transparente, que posee, entre otras sustancias, lactosa, peptonas, el colorante vital rojo neutro, sales biliares y violeta cristal.

Este medio es selectivo contra muchas Bacterias Gram.-positivas debido al violeta cristal, y también contra selecciona muchas gram.-negativas debido a las sales biliares (que son agentes tensioactivos que desorganizan muchas membranas externas). en cambio, las entero bacterias están evolutivamente adaptadas a soportar sales biliares en su hábitat natural (El intestino de vertebrados superiores), y pueden crecer en este Medio.

En su faceta de medio diferencial, el agar MacConkey permite visualizar dos tipos de Entero bacterias según que puedan o no fermentar la lactosa, con producción de ácidos. las bacterias fermentadoras de lactosa (lac+), excretan al medio gran cantidad de ácidos orgánicos, lo que provoca que sus colonias, y sus alrededores aparezcan de color rojo intenso, debido al viraje del rojo neutro; además, se forma un halo turbio a cierta distancia de estas colonias, fenómeno ocasionado por la precipitación de las sales biliares inducida por la acidez. en cambio, las bacterias lac-, al no poder usar la lactosa, recurren como fuente de c a las peptonas, a las que desaminan: incorporan el esqueleto carbonado, excretando iones nh4+, que alcalinizan el medio de cultivo, lo cual se traduce en que el indicador rojo neutro vira a amarillo.

NOTAS

[1] .- Quizá llame la atención del lector no ver citado aquí el Na. De hecho, el Na no es un requerimiento universal en las bacterias; sólo lo necesitan ciertos procariotas Marinos, de lagunas saladas, cianobacterias y Anoxifotobacterias.

[2]

Existen ejemplos de nitrogenadas "alternativas" en las que no existe FeMo-co, sino cofactores de hierro y vanadio (FeVa-co) o cofactores con solo sulfuro de Hierro. Se supone que estas nitrogenadas funcionan solo mecanismos de apoyo cuando en el medio no hay suficiente molibdeno.

REFERENCIAS. (BIBLIOGRAFÍA)

Nutrición microbiana

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Autor:

Eduardo Belmonte C.

Asignatura: Introducción a la Microbiología

Carrera: Microbiología industrial de los alimentos

Fecha: 21/ 04 / 2007.

Introducción a la Microbiología

LABORATORIO N°1 DE MICROBIOLOGIA

Partes: 1, 2