Un método nuevo para aislar e identificar directamente mutantes Nit- en Escherichia coli K12 (página 2)

METODOLOGÍA

1. Cepas y condiciones de crecimiento. Las cepas bacterianas de E. coli, de fagos y plásmidos utilizadas se describieron en la Tabla 1. Las bacterianas se incubaron a 30º C. Los cultivos anaeróbicos se prepararon sembrando en tubos totalmente llenos con el medio de cultivo, e incubando sin agitación; la anaerobiosis estricta se realizó bajo atmósfera de hidrógeno y dióxido de carbono, utilizando el sistema Gas-Pack.

2. Medios de cultivo. La composición del medio sintético y los suplementos adicionados fueron descritos en la Tabla 2. La composición de los medios ricos y diferenciales fue reportada (Miller 1972). Cuando se indicó fueron añadidos: 20mM de KNO3, 1mM de Na2Mo4, 16 mM de KClO3, 40 mM de fumarato de sodio, 2 mg/ml de casaminoácidos, 0,05 mg/ml de ampicilina, 0,1 mg/ml de 2,3,5 trifenil tetrazolio cloruro (TTC). Como fuente de carbono en los medios sintéticos se agregó 2 mg/ml de glucosa o lactosa y 4 mg/ml de glicerol, según el caso.

3. Experimentos genéticos. (3.1) Ensayos de ligamiento. La localización de la mutación pleiotrópica Nit- Gas- de las cepas MA se determinó por transducción generalizada con el fago P1vir, siguiendo el procedimiento de Lennox descrito por Miller (1972).

Las cepas MA se utilizaron como donante para transducir a las receptoras LCB413 y LCB559, según el cruce. Antes de sembrar, las mezclas de transducción fueron lavadas por centrifugación y concentradas diez veces. Los transductantes Gal+ fueron aislados en medio diferencial y los Met+ en medio sintético selectivo; una vez purificados en ese mismo medio fueron sometidos a los ensayos fisiológicos y fenotípicos indicados. El grado de ligamiento de la mutación se expresó como el porcentaje de Nit- Gas- respecto al total de clones transductantes ensayados Gal+ o Met+, según el caso.

(3.2) Obtención y caracterización de merodiploides heterocigotas. Una preparación conteniendo ADN del plásmido pSJE100 (moa+), obtenida por lisis alcalina de la cepa SE5000, se utilizó para transformar a la cepa RK5200, siguiendo las metodologías descritas (Sambrook et al. 1989). Transformantes Nit+ ApR fueron aislados por el método TNC aquí desarrollado y algunos clones independientes reaislados se sometieron a ensayos fenotípicos y fisiológicos. La presencia física del plásmido fue verificada en geles de agarosa al 1%, según la metodología descrita (Sambrook et al. 1989). 

4. Ensayos fisiológicos. (4.1) Crecimiento por resistencia al clorato (ChlR), se modificó el método original (Piéchaud et al. 1969) sembrando las bacterias en superficie o por rayado (Ortega de L. 1982). (4.2) Crecimiento utilizando nitrato como aceptor final de electrones, se sembró en superficie sobre medio sintético conteniendo glicerol y nitrato, e incubó en anaerobiosis estricta por 4 a 5 días (Lambden y Guest 1976). (4.3) Reducción del nitrato a nitrito (Nit+), se determinó espectrofotométricamente agregando reactivo de nitritos a cultivos crecidos anaeróbicamente en caldo nutritivo glucosado conteniendo nitrato (Showe y Demos 1968); en medio sólido se utilizaron colonias crecidas por rayado sobre agar nutritivo conteniendo glucosa, luego se colocó un papel filtro impregnado con nitrato y, después de 20 a 30ºC, se reemplazó por otro impregnado con reactivo de nitritos. (4.4) Reversión fenotípica por molibdato, se procedió igual al punto anterior pero suplementando el medio con molibdeno (Glaser y Demos 1971). (4.5) Reducción del nitrito (Nir+), se procedió igual que en 4.3 pero el nitrato se reemplazó por nitrito para verificar su desaparición con el crecimiento del cultivo (Abou-Jaoude et al. 1978). (4.6) Aparición de colonias rojas (TNC+), se evaluó durante el crecimiento usando el método TNC aquí desarrollado. (4.7) Liberación de gas (Gas+), se evidenció durante el crecimiento anaeróbico en tubos durham conteniendo caldo nutritivo glucosado (Puig et al. 1969). (4.8) Crecimiento utilizando fumarato como aceptor final de electrones (Frd+), se sembró en superficie sobre medio sintético conteniendo glicerol y fumarato, e inocubó en anaerobiosis estricta por 4 a 5 días (Lambden y Guest1976).

5. Ensayos fenotípicos. Los requerimientos nutricionales, fermentación de azúcares, resistencia a drogas, inmunidad a fagos y termosensibilidad fueron ensayados según Miller (1972).

6. Ensayos enzimáticos. La actividad NRA fue cuantificada espectrofotométricamente en células enteras inducidas crecimiento en anaerobiosis con nitrato), siguiendo la reacción de oxidación del donador artificial bencil viológeno (BV-H), dependiente del nitrato y bajo las condiciones descritas (Jones y Garland 1977); la concentración de nitritos producidos se cuantificó usando una curva de calibración. Las proteínas totales se determinaron según Lowry et al. (1951), y se usó una curva de calibración elaborada con albúmina bovina.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Desarrollo y estandarización del TNC como método nuevo para identificar mutantes Nit- afectados en cualquiera de los genes nar, mol y fnr.

Fimmel y Haddock (1979) desarrollaron un método muy eficiente para aislar, en forma directa y selectiva, mutaciones en chlC (operon narGHJI). Las cepas bacterianas mutantes se coloreaban de rojo, a diferencia de las silvestres y mutantes pleiotrópicas Nit- Gas- afectadas en chlA(moa) y chlB(mob) que permanecían incoloras después de 6 días de crecimiento en anaerobiosis estricta, en cajas de medio sintético (Vogel-Bonner) conteniendo glucosa, nitrato y tetrazolio (TTC).

En el presente trabajo, el método anterior fue sometido a una serie de modificaciones para ampliar su espectro de especificidad y lograr identificar una mayor variedad de genes mutados. Los cambios más importantes fueron los siguientes:

1. La composición del medio de cultivo. En la fórmula del medio sintético de Vogel-Bonner (Vogel y Bonner 1956), los aminoácidos fueron reemplazados por una solución de casaminoácidos libre de vitaminas. Se ensayaron concentraciones crecientes de tetrazolio (0,025 hasta 0,250 mg/ml), nitrato (1 hasta 2 mg/ml) y glucosa (1 hasta 4 mg/ml).

2. Las condiciones de aereación. Las cajas fueron incubadas con y sin anaerobiosis estricta, durante tiempos crecientes (1 hasta 6 días).

Cada modificación fue valorada comparando el comportamiento de capas de E. coli Nit-, seleccionadas por resistencia al clorato (Tabla 1, colección J. Puig) y sus respectivas isogénicas silvestres. Tres métodos de siembra fueron ensayados:

i. Agotamiento; ii. Rayado; iii. Siembra en superficie de una mezcla preparada a partir de dos cultivos de igual concentración celular, correspondientes a una cepa mutante y otra silvestre Nit+.

La mejor condición fue denominada TNC (tetrazolio nitrato casaminoácidos) (Tabla 2) y se escogió porque permitió evidenciar, más rápida y claramente, la coloración roja de las colonias (fenotipo TNC+), indistintamente de la mutación llevada por cada una de las cepas mutantes ensayadas; las cepas silvestres utilizadas como control permanecieron incoloras (fenotipo TNC-). Los resultados obtenidos fueron totalmente reproducibles en más de diez ensayos independientes. Esto también fue observado cuando se utilizaron mutaciones de deleción y de inserción en diferentes genes (Tabla 1).

Por lo tanto, el método TNC aquí desarrollado resultó ser más sencillo y presentó las siguientes ventajas adicionales: i. Es eficiente para detectar directamente mutantes Nit-, en cualquier gen nar, mol y fnr; ii. El color rojo de las colonias puede observarse tempranamente, a partir de las 24 hr. de incubación; los mejores resultados en la siembra de superficie son obtenidos con cantidades máximas de 2.000 colonias por caja; iii. No es necesario incubar bajo condiciones de anaerobiosis estricta.

Los resultados aquí obtenidos dejan sin validez la hipótesis de trabajo propuesta por Fimmel y Haddock (1979), para explicar bioquímicamente la no reducción del TTC en las cepas con mutaciones diferentes a chlC-.

Según esos autores, la citocromo oxidasa es inhibida por el bajo pH resultante de la acumulación del ácido fórmico producido durante el crecimiento anaeróbico, en ausencia de un sistema Formiato Hidrógeno Liasa (FHL) funcional.

Todos los mutantes aquí utilizados (Tabla 1) se chequearon previamente para los fenotipos Nir, Nit, reversión fenotípica por molibdato y Frd, a tiempos crecientes de incubación en los medios de cultivo: 24, 48 y 72 horas. Los resultados se correspondieron con lo esperado (Stewart 1988), excepto para los mutantes afectados en el operón moe (chlE) que fueron capaces de revertir con molibdato después de las 48 h de incubación. Esto último permitió establecer un criterio preliminar de clasificación fisiológica para los mutantes Nit- Gas- basado en cuatro subclases genotípicas (Tabla 3).

Comparación del método TNC con el de resistencia al clorato, para aislar mutantes Nit.

La resistencia al clorato (ChlR) es un método de alta eficiencia que, permite seleccionar directamente mutantes Nit-, por su capacidad de crecer en agar nutritivo con glucosa y clorato, en un lapso de 4 a 5 días de incubación en anaerobiosis estricta (Piéchaud et al. 1969). Es tradicionalmente utilizado para tal fin, pero la mayoría de los mutantes ChlR llevan mutaciones en los genes mol (moa, mod o moe) y preferencialmente en moa o mob (Piéchaud et al. 1969, Case 1970, Glaser y DeMoss 1972).

Sin embargo, el método TNC aquí desarrollado ofrece otras ventajas: i. Se basa en el uso de un medio semisintético diferencial, lo cual evita la presencia de compuestos bacterianos tóxicos como manera de ejercer una presión selectiva, ii. Los resultados se observan una presión selectiva, ii. Los resultados se observan tempranamente, durante el crecimiento de las colonias, iii. No se requiere anaerobiosis estricta.

Con el propósito de valorar la aplicación del TNC, como un método nuevo y alternativo al de resistencia al clorato, ambos fueron utilizados para aislar mutantes ApR previamente inducidos por mutagénesis biológica (Ortega de L. y Orozco de S. 1982) usando el fago MudI (Casadaban y Cohen 1979).

El porcentaje de clones ApR TNC+ fue considerablemente superior al de ApR ChlR: 1,2% y 0,4%, respectivamente (Tabla 4), y, es posible atribuirlo a la presión selectiva ejercida por el clorato. Cientos de clones independientes aislados por cada método fueron retenidos y relacionados como MA. Se escogieron aquellos que cumplían con las características de la receptora, y se examinaron los fenotipos Nit-, TNC+ y ChlR. La correspondencia observada entre esos tres fenotipos fue inferior al 100% (Tabla 4), por lo tanto, ninguno de los dos métodos fue totalmente específico para aislar mutantes Nit-. Sin embargo, el valor corregido de la frecuencia de mutantes Nit- TNC+ fue 6,2 x 10-3 que, es aproximadamente 3 veces superior a 2,6 x 10-3 obtenido con el método ChlR.

Valoración del TNC como método que permite aislar un mayor espectro de genes mutados.

Los mutantes MA que resultaron Nit-, se clasificaron preliminarmente en diferentes subclases genéticas (Tabla 5), aplicando el criterio descrito en la Tabla 3.

Efectivamente, el método de resistencia al clorato fue de mayor especificidad para aislar mutantes pleiotrópicos Nit- Gas- (98,5%). Por su parte, el TNC permitió aislar eficientemente mutantes no pleiotrópicos (21%) y pleiotrópicos (79%), con una mayor distribución de genes mutados. Con ambos métodos se aislaron posibles mutantes en fnr, pero el TNC mostró el mayor porcentaje.

Todos los mutantes pleiotrópicos ensayados conservaron la capacidad de crecer anaeróbicamente en medio sintético a expensas de glucosa, lo cual descartó la presencia de una mutación ana (30). Doce mutantes pleiotrópicos, excluyendo los posibles mod-, fueron ensayados bioquímicamente y todos resultaron defectivos en la actividad enzimática de la NRA. Seis de ellos fueron analizados genéticamente transduciendo la mutación a una cepa receptora que presentaba un marcador de aislamiento (gal o met, según el cruce), ligado al posible gen mutado (Tabla 6).

Clones recombinantes para el marcador respectivo fueron aislados y caracterizados: todos los TNC+ fueron Nit- Gas- y todos los TNC- permanecieron Nit+ Gas+. El valor de cotransducción de Nit- Gas- se comparó con criterios previamente establecidos: entre 20% y 32% con gal+ indicaba mutaciones moa (2,18,31), entre 9% y 17% con met+ eran mob (15) y un 3% con gal+ eran moe (2,18,32,33). Los valores obtenidos en los distintos cruces realizados (Tabla 6) mostraron una estrecha correspondencia con el tipo de mutación estimada según la clasificación fisiológica preliminar (Tabla 3), lo cual aportaba confiabilidad a este criterio.

Las cepas donantes MA14, 31 y 45 habían sido aisladas 4como mutantes ApR TNC+, entonces fue posible proponer al TNC como un método alternativo pero que permite alcanzar una mayor frecuencia y distribución de genes mutados, detectando simplemente la aparición de colonias rojas.

Aplicación del método TNC para otros fines genéticos.

Clones merodiploides heterocigotas moa+ / moa– se construyeron transformando una cepa mutante moaA– 200::Mucts (RK5200) con el plásmido pSJE100 que porta el operón moa+. El fenotipo TNC- (colonias incoloras) se utilizó en combinación con el marcador ApR del plásmido, para aislar transformantes silvestres Nit+ Gas+. De doce clones independientes reaislados, todos ellos mostraron restauración en trans de ambos fenotipos; la presencia del plásmido fue comprobada físicamente.

Transformantes merodiploides heterocigotas para el operón narC, se han aislado aplicando el método TNC, observándose además que, la intensidad del color de las colonias variaba, según el porcentaje de restauración del fenotipo Nit+ (datos no presentados).

El método TNC se ha valorado ampliamente con fines genéticos diversos, obteniéndose muy buenos resultados (Ortega de L. 1982,1985, Ortega de L. y Ball 1985, Ortega de L. y Díaz 1995).

CONCLUSIONES

1. El método TNC aquí desarrollado es recomendable por su sencillez, eficiencia y confiabilidad para aislar, identificar y cotransferir fenotipos Nit+ (TNC-) y Nit- (TNC+) de procedencia genómica o plasmídica.

2. Por lo tanto, puede ser utilizado con diferentes propósitos, entre otros:

Construir simplemente cepas bacterianas nuevas; Estudios de ligamiento dirigidos a mapear mutaciones TNC+ recién aisladas; Estudios fisiológicos y de regulación; Análisis de estructura fina.

AGRADECIMIENTOS

Al Dr. J. Puig (Facultad de Ciencias, Universidad de Los Andes, Mérida, Venezuela) por la generosa donación de sus cepas. Igualmente agradezco al Dr. M.

Chippaux (L.C.B., C.N.R.S., Marsella, Francia) por suministrarme la cepa SE5000 del Dr. D. Boxer, y al Dr.

M. Dubourdieau (Facultad de Ciencias, U.L.A., Mérida, Venezuela) por las cepas del Dr. V. Stewart. El apoyo financiero de este trabajo fue suministrado por el CDCHT-ULA, Venezuela, a través de distintos proyectos.

REFERENCIAS

Abou-Jaoude M, Pascal MC, Casse F, Chippaux M. 1978. Isolation and phenotypes of mutants from Escherichia coli K-12 defective in nitrite-reductase activity. FEMS Microbiol. Lett. 3: 235-239.

Amy NK, Rajagopalan KV. 1979. Characterization of the molybdenum cofactor in Escherichia coli. J. Bacteriol. 140: 114 – 124.

Bachmann BJ. 1990. Linkage map of Escherichia coli K-12, Edition 8. Microbiol. Rev. 54: 130-197.

Baker K, Boxer D. 1991. Regulation of the chlA locus of Escherichia coli K12: Involvement of the molybdenum cofactor. Mol. Microbiol. 5: 901-907.

Ball M, Ortega de L M. 1985. Aislamiento y caracterización de mutantes de Escherichia coli K12 chl::Tn10(TetR). Acta Científica Venezolana 36 (Supl): XXXV Convención Anual de AsoVAC, Venezuela.

Bonnefoy Orth V, Lepelletier M, Pascal MC, Chipaux M. 1981. Nitrate reductase and cytochrome b-nitrate reductase structural genes as parts of the nitrate reductase operon. Mol. Gen. Genet. 181: 535-540.

Casadaban M, Cohen S. 1979. Lactose genes fused to exogenous promoters in one step using a Mu-lac bacteriophage: in vitro probe for transcriptional control sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4530-4533.

Case F. 1970. Mapping of the genes chlB controlling membrane-bound nitrate reductase and formic hydrogen lyase activities in Escherichia coli K12. Biochim. Biophys. Acta 39: 429-436.

Dagert M, Puig J. 1976. Mapeo del gen chlE en Escherichia coli K12. Acta Cient. Venez. 27: 85-87.

Edwards E, Rondeau S, DeMoss J. 1983. chlC (nar) operon of Escherichia coli includes structural genes for and subunits of nitrate reductase. J. Bacteriol. 153: 1513- 1520.

Fimmel A, Haddock B. 1979. Use of chlC-lac Fusions to Determine Regulation of gene chlC in Escherichia coli K12. J. Bacteriol. 138: 726-730.

Glaser JH, DeMoss JA. 1971. Phenotypic restoration by molybdate of nitrate reductase activity in chlD mutants of Escherichia coli. J. Bacteriol. 108: 854-860.

Glaser, JH, DeMoss JA. 1972. Comparison of nitrate reductase mutants of Escherichia coli selected by alternative procedures. Mol. Gen. Genet. 116: 1-10.

Iobbi-Nivol Ch, Palmer T, Whitty P, McNairm E, Boxer D. 1995. The mob locus of Escherichia coli K-12 required for molybdenum cofactor biosynthesis is expressed at very low levels. Microbiol. 141: 1663-1671.

Jenkins H, Haddock B. 1980. A specific method for the isolation of chlG mutants of Escherichia coli K12. FEMS Microbiol. Lett. 9: 293-296.

Johnson M, Rajagopalan K. 1987. Involvement of chlA, E, M, and N loci in Escherichia coli molybdopterin synthesis. J. Bacteriol. 169: 117-125.

Jones R, Garlan P. 1977. Sites and specificity of the reaction of bipyridylium compounds with anaerobic respiratory enzymes of Escherichia coli. Effects of permeability barriers imposed by the cytoplasmic membrane. Biochem. J. 164: 199-211.

Lambden PR, Guest JR. 1976. Mutants of Escherichia coli K12 unable to use fumarate as an anaerobic electron acceptor. J. Gen. Microbiol. 97: 145-160.

Lee JH, Wendt JC, Shanmugan KT. 1990. Identification of a new gene, molR, essential for utilization of molybdate by Escherichia coli. J. Bacteriol. 172:2079-2087.

Li J, Kustu S, Stewart V. 1944. In vitro interaction of nitrate-responsive regulatory protein NarL with DNA target sequences in the fdnG, narG, narK and frdA operon control regions of Escherichia coli K-12. J. Mol. Biol. 241: 150-165.

Lowry O, Rosebrough N, Farr A, Randall R. 1951. Protein determination with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193 265-275.

Maupin-Furlow J, Rosentel J, Lee J, Deppenmeier U, Gunsalus R, Shanmugan K. 1995. Genetic analysis of the modABCD (molybdate transport) operon of Escherichia coli. J. Bacteriol. 177: 4851-4856.

Mejean V, Iobbi NC, Lepelletier M, Giordano, G, Chippaux M, Pascal MC. 1944. TMAO anaerobic respiration in Escherichia coli: involvement of the tor operon. Mol. Microbiol. 11: 1169-1179.

Miller JH. 1972. Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York.

Noho T, Kasai Y, Saito T. 1988. Cloning and sequencing of the Escherichia coli chlEN operon involved in molybdopterin biosynthesis. J. Bacteriol. 107: 4097-4102.

Ortega de LM. 1982. Obtención y caracterización preliminar de clones transductantes de Escherichia coli K12 llevando fusiones chl:Mud1, seleccionados utilizando tres métodos diferentes. Tesis de Maestría en Biología Molecular. Universidad de Los Andes. Mérida. Venezuela.

Ortega de LM. 1985. Regulación fisiológica de los genes chl de Escherichia coli K12, llevando mutaciones espontáneas y de fusión chl::lac. Trabajo de Ascenso. Universidad de Los Andes. Mérida. Venezuela.

Ortega de LM. 1998. El gen narG y el operón moa(ABCDE) como posibles reguladores de la respiración anaeróbica del nitrato, en Escherichia coli K12. MedULA 7: 5-12.

Ortega de LM, Díaz J. 1995. Caracterización de una mutación nar y su efecto sobre la expresión transcripcional de una fusión moa::lac en Escherichia coli K12. MedULA 4: 31-39.

Ortega de LM, Orozco de SA. 1982. Fusión de los genes lac del fago Mud1 a los genes chl del sistema nitrato reductasa de Escherichia coli K-12. Acta Científica Venezolana 33 (Supl).

Pascal MC, Chippaux M, Abou-Jaounde A, Blaschkowski H, Knappe J. 1981. Mutants of Escherichia coli K12 with defects in anaerobic pyruvate metabolism. J. Gen. Microbiol. 124: 35-42.

Piéchaud M, Pichinoty F, Azoulay E, Counchound- Beaumont P, Gendre J. 1969. Recherches sur des mutants bactériens ayant perdu les activités catalytiques liées a la nitrate-reductase A. I. Description des méthodes d'isolement. Ann. Inst. Pasteur (Paris) 116: 276-287.

Puig J, Azoulay E, Gendre J, Richard E. 1969. Etude génetique des mutans de la région chlA chez l'Escherichia coli K-12. C. R. Acad. Sci. (Paris) 268: 183-184.

Puig J, Azoulay E, Pichinoty F, Gendre J. 1969. Genetic mapping of the chlC gene of the nitrate reductase A system in Escherichia coli K12. Biochem. Biophys. Res. Comm. 35: 659-662.

Reiss J, Kleinhofs A, KlingMuller W. 1987. Cloning of seven differently complementing DNA fragments with chl functions from Escherichia coli K12. Mol. Gen. Genet. 206: 352-355.

Rivers SL, McNairm E, Blasco F, Giordano G, Boxer DH. 1993. Molecular genetics analysis of the moa operon of Escherichia coli K-12 required for molybdenum cofactor biosynthesis. Mol. Microbiol. 8: 1071-1081.

Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York.

Shanmugan KT, Boxer DH, Cole JA, Chippaux M, DeMoss JA, Giordano G, Guest J, Gunsalus RP, Lin ECC, Rajagopalan KV, Stewart V. 1992. Proposed nomenclature for the genes involved in molybdenum metabolism in Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Mol. Microbiol. 6: 3452-3454.

Shimokawa O, Ishimoto M. 1979. Purification and some properties of inducible tertiary amine N-oxide reductase from Escherichia coli. J. Biochem. 86: 1709- 1717.

Showe M, DeMoss J. 1968. Localization and regulation of synthesis of nitrate reductase in Escherichia coli. J. Bacteriol. 95: 1305-1313.

Sodergren EJ, DeMoss JA. 1988. NarI region of the Escherichia coli nitrate reductase (nar) operon contains two genes. J. Bacteriol. 170: 1721-1729.

Spiro S, Guest J. 1990. FNR and its role in oxygenregulated gene expression in Escherichia coli. FEMS Microbiol. Rev. 75: 399-428.

Stewart V. 1988. Nitrate respiration in relation to facultative metabolism in Enterobacteria. Microbiol. Rev. 52: 190-232.

Stewart V, MacGregor C. 1982. Nitrate Reductase in Escherichia coli K12: involvement of chlC, chlE and chlG loci. J. Bacteriol. 151: 788-799.

Takahashi K, Hattori T, Nakanishi T, Nohno T, Fujita N, Ishihama A, Taniguchi S. 1944. Repression of in vitro transcription of the Escherichia coli fnr and narX genes by FNR protein. FEBS Lett. 340: 59- 64.Venables W, Guest J. 1968. Transduction of nitrate reductase loci of Escherichia coli by phages P1 and ë. Mol. Gen. Genetics 103: 127-140.

Vogel H, Bonner D. 1956. Acetylornithinase of Escherichia coli: partial purification and some properties. J. Biol. Chem. 218: 97-106.

Mariemma Ortega de LópezLaboratorio Organización y Expresión del Gen. Departamento de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad de Los Andes. Mérida. Venezuela. E-mail: