Un método nuevo para aislar e identificar directamente mutantes Nit- en Escherichia coli K12

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• Resultados y discusión
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• Referencias

Resumen: Los métodos para aislar e identificar mutantes defectivos en la respiración anaeróbica del nitrato (Nit-) tienden a ser más específicos para ciertos genes mutados. En el presente trabajo se desarrolló un método denominado TNC, basado en una modificación del publicado por Fimmel y Haddock (1979), pero con mayores ventajas: no fue necesario incubar en anaerobiosis estricta, permitió ampliar el espectro de genes mutados (incluyendo mol y fnr) y detectar la aparición de colonias rojas muy rápidamente, en sólo 24 horas de crecimiento. La frecuencia de mutantes Nit- y la distribución de genes mutados fueron superiores, al usarlo comparativamente con el método de selección por resistencia al clorato.

El TNC resultó muy sensible y con reproducibilidad para identificar diferencialmente clones mutantes Nit- (TNC+) y silvestres Nit+ (TNC-); además fue eficiente para caracterizar cepas bacterianas y en los análisis genéticos. En el presente trabajo también se estableció y evaluó un criterio de clasificación fisiológica para agrupar preliminarmente a los mutantes pleiotrópicos Nit- Gas– en cuatro subclases genotípicas, al observar que las mutaciones en moe revertían fenotípicamente con molibdato, en forma tardía.

Palabras claves: Nit- Gas- identificación; Nit- Gas- aislamiento; molibdato reversión; mol; fnr; narC.

Abstract: A new method for the direct isolation and identification of nit-mutants in Escherichia coli K12.

The methods to isolate and to identify defective mutants in the nitrate anaerobic respiration (Nit-) tend to be preferential for certain mutated genes. This work presents a method denominated TNC, based in a modification of Fimmel and Haddock published in1979, but with highest advantages: it was not necessary to incubate with strict anaerobiosis, permitted both to amplify the spectre of mutated genes (including mol y fnr) and to detect very quickly the appearing red colonies, in only 24 hours of growth. Using it comparatively with the method of selection for chlorate resistance, the frequency of Nit- mutants and the distribution of genes mutated were higher. The TNC showed to be very sensitive and with reproducibility to identify differently Nit- mutants (TNC+) and Nit+ wild type (TNC-) clones; furthermore, it was efficient for the characterisation of bacteria strains and the genetic analysis. In the present work it was also established and evaluated a criteria of physiologic classification for preliminary grouping pleiotropic Nit- Gas- mutants in four genotypic subclass, by observing that moe mutations could be reverted phenotypically in late form with molybdate.

Key words: Nit- Gas- identification; Nit- Gas- isolation; molybdate reversion; mol ; fnr ; narC

INTRODUCCIÓN

Los estudios con cepas mutantes han representado un gran aporte para el conocimiento de los fenómenos biológicos, de allí la importancia de contar con métodos eficientes que permitan el aislamiento e identificación de las mismas. En el caso de E. coli, la pérdida de actividad Nitrato Reductasa A (NRA) ocasiona la aparición de mutantes defectivos en la respiración anaeróbica del nitrato (fenotipo Nit-) (Showe y Demoss1968, Piéchaud et al. 1969). La NRA es una molibdoenzima (apoNRA + molibdocofactor MoCo); su actividad respiratoria puede ser afectada por mutaciones que mapean en al menos tres clases distintas de genes, y sus efectos son diversos.

Mutaciones en los operones nar C (narGHJI) y narXL, afectan particularmente la biosíntesis de la apoNRA (Bonnefoy-Orth et al. 1981, Stewart y MacGregor 1982, Edwards et al. 1983, Sodergren y Demos 1988, Stewart 1988, Bachman 1990, Stewart 1993). Por su parte, las mutaciones mol (anteriormente chl) (Piéchaud et al. 1969; Shanmugan et al 1992) incluyen los operones moa, mob, mod, moe, los genes mog y molR, y afectan pleiotrópicamente la activación de diferentes molibdoenzimas, reductasas y deshidrogenasas, que comparten el mismo MoCo, como ejemplos la NRA y la FDH-L (fenotipo Nit- Gas-) (Johnson y Rajagopalan 1987, Bachman 1990, Lee et al. 1990, Baker y Boxer 1991, Rivers et al. 1993, Iobbi-Nivol et al. 1995, Maupin-Furlow et al. 1995). Mutaciones en el gen fnr también ocasionan pleiotropía, al afectar la biosíntesis de las molibdoenzimas NRA y trimetil amino N-óxido reductasa (TMAO), además de las no molibdoenzimas fumarato y nitrito reductasas (fenotipo Nit- Tor- Frd- Nir-) (Lambden y Guest1976, Stewart y MacGregor 1982, Stewart 1988, Spiro y Guest 1990, Takahashi et al. 1994).

Los métodos desarrollados para aislar e identificar mutantes Nit- de E. coli, tienden a ser preferenciales para ciertos genes mutados, tal como se indica a continuación:

1. Selección directa por resistencia al clorato (Piéchaud et al. 1969). Se basa en la sobrevivencia frente a la toxicidad que conlleva la reducción anaeróbica de este compuesto.

Fue el primer método desarrollado y es el más extensamente utilizado; la gran mayoría de los mutantes ChlR (98%) están afectados en los genes mol, particularmente en los operones moa (chlA) y mob (chlB) (Puig et al. 1969, Case 1970, Glaser y Demos 1972).

2. Identificación por incapacidad de crecer anaeróbicamente con nitrato como aceptor final. Se utilizan los medios sintéticos:

i. Lactato-Nitrato, diseñado específicamente para mutaciones en el operón narC (Venables y Guest 1968) y ii. Glicerol-Nitrato, se usa para los Nit- en general (Lambden y Guest 1976).

3. Identificación por incapacidad de reducir anaeróbicamente el nitrato a nitrito. Utilizando la glucosa, se identifican los mutantes Nit- en general (Showe y Demos 1968, Piéchaud e al. 1969), pero el formiato tiende a ser preferencial para los afectados en el operón narC (Glaser y Demos 1972).

4. Identificación por coloración roja de las colonias, durante el crecimiento anaeróbico estricto en medio sintético suplementado con nitrato y tetrazolio. Fue diseñado específicamente para mutaciones en el operón narC (Fimmel y Haddock 1980), pero usando cepas merodiploides homocigotas para mog+ (chlG+) se obtienen mutantes afectados en este gen (Jenkins y Haddock 1980).

Considerando las restricciones de los métodos arriba escritos, el presente trabajo estuvo dirigido a desarrollar un método nuevo que, permitiera incrementar la posibilidad de aislar e identificar la gran diversidad de genes mutados, responsables del fenotipo Nit-. Este método fue denominado TNC y tuvo como base el reportado por Fimmel y Haddock (1979). Se ensayó comparativamente con el de resistencia al clorato, para evaluar su capacidad de ampliar la frecuencia y diversidad de genes mutados.

También se evaluó su confiabilidad como un método sencillo y rápido para distinguir eficientemente entre cepas Nit+ (TNC-) y Nit- (TNC+).