Cuando un caldo es aireado, P0 generalmente cae debido al tamaño en crecimiento de las cavidades dentro de las paletas del agitador. Algunos Nº de potencia de agitadores no aireados son una función del Nº de Re. En flujo turbulento (Re > 4000) en ausencia de aireación el valor de Nº de potencia para un agitador tipo turbina de 6 hojas es constante e igual a 5. En régimen laminar (Re < 1000) hay una proporcionalidad inversa con el Re, Ej para el agitador Rushton (P0 64 / Re) Cuando se usan concentraciones altas de organismos filamentosos, los filamentos ramificados del micelio interactúan entre ellos y forman agregados que disminuyen el flujo libre del líquido. Esto resulta en una viscosidad alta y un comportamiento pseudoplástico ó elástico. Observaciones similares se han hecho cuando un microorganismo excreta sustancias poliméricas, como el xantano. La disminución de la transferencia de masa se debe en parte a la estimulación de la coalescencia de las burbujas, para formar burbujas grandes en el caldo. El Hold up es menor, por lo tanto el área interfacial será pequeña. En reactores grandes bajo condiciones extremas, se pueden observar burbujas de 1 m de diámetro. Algunas veces este efecto se compensa parcialmente por la presencia simultánea de un gran Nº de pequeñas burbujas (diámetro < 1 mm)
que tienen un tiempo de residencia largo en el caldo (15 min ó más). Hay también un efecto de viscosidad sobre kl. Esto se debe a la disminución de la velocidad del líquido, y no a una consecuencia directa de la viscosidad por si misma. En caldos aireados la potencia de entrada puede disminuir por el tamaño de las cavidades a medida que las paletas del agitador sean más grandes. Esto disminuirá las velocidades de corte y la ruptura de las burbujas. Para tanques agitados y medios no coalescentes: kla = 0.002 (Ps / Vl) 0.7 (vg p0 / p) 0.2 (µ / µ 0) – 0.7 Puesto que µ = µ0 donde µ0 = 0.05 Pa s. Ps: potencia de entrada del agitador (W) µ: viscosidad dinámica (kg / m seg) µ0 : viscosidad dinámica de referencia (kg / m seg) Si el caldo tiene un comportamiento pseudoplástico (la viscosidad disminuye con la velocidad de corte alta) ó fluído dilatante ( la viscosidad aumenta con velocidades de corte altas), se puede tomar una viscosidad promedio en el reactor: µ = K ? n – 1 ? : velocidad de corte promedio (1 / seg)
Que se puede estimar como: ? = 10 N K: índice de consistencia n: índice de ley de potencia Los parámetros K y en el modelo reológico dependen de la concentración de la biomasa. Típicamente K es proporcional a Cax con el valor de a entre 1.5 y 4. Para caldos pseudoplásticos n < 1, para líquidos dilatantes n > 1, y para medios Newtonianos n = 1. Transferencia de masa líquido – sólido La descripción de la transferencia de masa a través de una película líquida ó desde la superficie de un sólido es mucho más simple que para la transferencia gas – líquido. kl es dependiente de las propiedades sólido – líquido, y el valor del área interfacial puede ser determinado experimentalmente. Usualmente la transferencia sólido – líquido se aplica a situaciones donde la transferencia de masa y la reacción están interactuando: un sustrato es transportado a través de la película líquida a la superficie de una partícula donde los microorganismos están presentes para consumir el sustrato. Los productos formados son transportados a través de la película al volumen total del líquido. Estas situaciones se tratan a menudo en términos de cinética aparente, Ej: la velocidad de reacción observada se describe con expresiones cinéticas standard, se introduce un factor de efectividad (entre 0 y 1) para describir el comportamiento de la reacción comparado a la misma reacción sin limitaciones de transporte.
Transferencia de masa dentro de una partícula sólida Cuando hay microorganismos activos dentro de una partícula ó agregado celular, el transporte (por difusión) dentro de las partículas puede presentar otra resistencia. Esta situación se encuentra en procesos biocatalíticos con células inmovilizadas en alginato ó partículas sólidas porosas. Una descripción apropiada del fenómeno es difícil debido a que la cinética de las reacciones microbianas dentro de la partícula pueden diferir grandemente de aquellas con células suspendidas libremente, y por lo tanto desconocido. Esto es debido a condiciones fisiológicas alteradas para las células. Además de un factor de efectividad para la transferencia de masa externa, aparece un factor de efectividad total que incluye también la resistencia intrapartícula. Determinación del coeficiente volumétrico de transferencia de masa Para estimar el valor de kla en los bioreactores se diseñan una serie de experimentos. Se usan modelos fluídos, tales como agua ó soluciones salinas, si es necesario con pulpa de papel ó polímeros agregados para imitar un caldo viscoso, y ver que se puede esperar en sistemas reales. Hay diversos métodos:
Método de la reacción química: Trata de imitar una reacción microbiana, el componente transferido puede ser consumido ó producido en una reacción química. Para estudios de transferencia de oxígeno, se puede usar el sulfito, que se oxida rápidamente a sulfato en la presencia de oxígeno y un catalizador. Kla se determina según midiendo la velocidad de consumo del sulfito. J a = kla (C* – C) (2) J: flujo de masa molar (mol / m2 seg) a: área interfacial por unidad de volumen de líquido (1/m) El producto J a = dCsulfito / dt , y C* = p / H para el oxígeno. Para obtener resultados seguros , se debe imponer la condición de que C es 0. Como alternativa para el sulfito se puede usar glucosa en combinación con la glucosa oxidasa (el oxígeno es consumido), ó una mezcla de agua oxigenada y catalasa ( el oxígeno es producido). También se pueden usar soluciones de Na(OH) para estudiar la transferencia de dióxido de carbono (el dióxido de carbono reacciona rápidamente con OH -.
Método del reemplazo físico: Consideramos un gas que es distribuido en estado estacionario, tal que C* es igual a C. El experimento comienza cuando la fracción molar de oxígeno en la fase gaseosa se cambia rápidamente del estado estacionario a otro valor. Por Ej. El nitrógeno gaseoso dispersado en un líquido es reemplazado por aire. El término J a es igual a dC /dt y por medidas continuas de la [O2] en el líquido, se puede evaluar kla de la ecuación (2). Otra posibilidad es un cambio súbito en la presión del componente a ser transferido. Este método es muy rápido, por lo tanto se requiere de un electrodo de oxígeno para medir la respuesta. Si se requiere un valor real de kla, se deben aplicar teorías, modelos de sistemas y correlaciones pre establecidas. Para determinar kla en cultivos en crecimiento, se usan los siguientes métodos: Método de la bioreacción en estado estacionario: cuando usamos un sistema microbiano que consume oxígeno, el kla se calcula también a partir de la ecuación (2): J a = kla (C* – C) J a, C* y C deben ser conocidos, y la diferencia (C* – C) lo suficientemente grande. Ej: para el oxígeno, J a (OTR) será igual a la diferencia de las fracciones molares de oxígeno a la entrada y a la salida, multiplicadas por las velocidades de gas a la entrada y la salida.
Velocidad de transferencia de oxígeno (OTR) = velocidad de consumo de oxígeno (OUR) . C*, teniendo en cuenta la presión parcial de oxígeno (C* = p / H), y C puede leerse usando un electrodo de oxígeno disuelto. Método dinámico: Cuando el flujo de aire es temporariamente reducido (se corta), ó bien es reemplazado por nitrógeno en un cultivo que respira. kla para el oxígeno se vuelve cero, y la concentración de oxígeno disuelto cae rápidamente. La velocidad de disminución, dC / dt representa a la velocidad de consumo de oxígeno (q). Cuando se restablece la velocidad de flujo de oxígeno, la concentración retornará a su valor inicial. Con la ecuación (2) J a = kla (C* – C) se determina kla, ahora el término J a es igual a dC / dt + q. Este método es aplicable sólo para fermentadores pequeños (< 100 l), porque para fermentadores grandes la composición de la fase gaseosa no será uniforme después de dispersar con nitrógeno (el hold up del gas debe built up aún cuando se corta el flujo de gas). En cualquier caso se necesita un electrodo de oxígeno.
El oxígeno como sustrato
El crecimiento en un cultivo microbiano con un sustrato limitante se expresa como: S µ = µmáx ———— KS + S
Con el oxígeno como sustrato S = C, que es la concentración de oxígeno. Cuando la velocidad de crecimiento en la fase de equilibrio se relaciona con la velocidad específica de absorción de oxígeno, se establece la ecuación siguiente:
CL QO2 = Qm ————- KO2 + CL
K02 : cte de Michaelis Menten para el oxígeno QO2 : velocidad específica de toma de oxígeno / peso seco celular (mM oxígeno / gr hr) Qm : velocidad específica máxima de toma de oxígeno Cuando el valor Qm se relaciona con la biomasa / l, se obtiene la velocidad de absorción de gas y de toma de oxígeno que se debe conseguir durante la fermentación.
x Qm = kLa (c* – cL) (mM oxígeno / l hr) x: concentración de células (peso seco gr / l)
La velocidad de absorción de gas no es constante durante la fermentación ya que si un sustrato diferente del oxígeno se hace limitante, como sucede al final de la fase logarítmica, el valor puede ser reducido.
Durante la fermentación de los organismos unicelulares y los productores de micelio existe una diferencia característica en la velocidad de absorción de oxígeno.
Durante el crecimiento logarítmico, la velocidad de absorción de oxígeno aumenta y el contenido en oxígeno en el caldo desciende hasta que se hace limitante. Después con bacterias unicelulares la velocidad de absorción de oxígeno es constante hasta que otro sustrato se haga limitante.
Sin embargo en fermentaciones miceliales (estreptomicetos y hongos), la velocidad de absorción desciende cuando el oxígeno se hace limitante, debido al aumento en el volumen del micelio y al aumento en la viscosidad relativa.
Concentración crítica de oxígeno
La concentración crítica de oxígeno es el término utilizado para indicar el valor de la velocidad específica de absorción de oxígeno que permite la respiración sin impedimentos.
A velocidades de absorción de oxígeno que son más bajas que las concentraciones críticas, la velocidad de respiración se correlaciona con la concentración de oxígeno en la solución. Por encima de este valor no se observa dependencia entre la velocidad de respiración y el oxígeno disuelto. En fluídos Newtonianos, como los que existen en las fermentaciones de organismos filamentosos (Ej: durante la producción de novobiocina con Streptomyces niveus), la concentración crítica de oxígeno depende de las condiciones de la fermentación.
Concentraciones críticas de oxígeno de algunos organismos Organismo Ccrít (mg/l) E. Coli 0.26 Penicillium chrysogenum 0.40 Sacharomyces cerevisiae 0.60 Pseudomonas ovalis 1.10 Torulopsis utilis 2.00
Velocidad de consumo de oxígeno y concentración de oxígeno disuelto, en condiciones de limitación de oxígeno Cultivo bacteriano Fermentación fúngica velocidad de absorción de oxígeno ——- CLconcentración de oxígeno disuelto
El efecto de la escala sobre la transferencia de masa Scale up: para bioreactores en gran escala, la transferencia de oxígeno es mejor que en una escala laboratorio ó un reactor de planta piloto. Esto se debe a una contribución > de la fase gaseosa (velocidad superficial del gas superior), y una fuerza impulsora más grande (presión en el espacio de cabeza alta y una presión hidrostática de cabeza. La mayoría del oxígeno es transferido en la región cerca del agitador. El caldo pasa a través del agitador hacia fuera y adentro del cuerpo del reactor y regresa de nuevo al agitador, se consume más oxígeno de lo que se transfiere y por lo tanto la concentración de oxígeno disminuirá. En un reactor tanque agitado grande ese camino de circulación del líquido puede llegar a ser de 10 m. Con una velocidad de líquido de 1 m/seg, el tiempo de circulación será de 10 seg. En el peor de los casos (no existe transferencia fuera de la región del agitador), pasarán 10 seg antes de que el oxígeno vuelva a depleted en el loop. Por lo tanto la concentración de oxígeno en el compartimento del fondo debe ser alta para que la depletion de oxígeno que perjudicaría al estado microbiano y la velocidad de
formación de producto, sea evitada. Según la ecuación J a = kla (C* – C), la velocidad de transferencia de masa será < porque la fuerza impulsora (C* – C) en el fondo del reactor es baja porque C* y C son altos. En un bioreactor grande la OTR tiene limitaciones máximas debido a las siguientes restricciones: Pueden haber dificultades de construcción mecánicas en fermentadores muy grandes (> 300 m3). Además el transporte de líquido y el mezclado se vuelven muy lentos con respecto a la transferencia de masa y a la reacción, por lo tanto se ve afectada la velocidad de la reacción total. También hay limitaciones en el enfriamiento que se vuelven muy significativas. La potencia promedio de entrada no debe exceder los 5 kW m3. Los microorganismos superiores pueden ser dañados en áreas donde el valor de potencia es localmente muy alto. Además los costos de energía y mantenimiento del motor también serán excesivamente altos. La presión correspondiente a la velocidad superficial de aire debe estar por debajo de 0.1 m/seg. Los costos del compresor también son restrictivos y un hold up alto de aire aumentará con el costo del espacio que ocupe el caldo de fermentación en el reactor. La presión en el espacio de cabeza tiene un máximo por razones mecánicas. Además la presión parcial de CO2 aumentará inhibiendo al crecimiento y a la producción. La fase gaseosa no se puede considerar idealmente mezclada. La presión parcial
de oxígeno cae a medida que las burbujas viajan a través del reactor, y esto reduce la fuerza impulsora para la transferencia de masa. En reactores más grandes que 10 m3, el proceso de transporte de líquido y masa se vuelve lento. La transferencia de masa y circulación del líquido interfieren entre sí , por lo tanto deben ser tratadas juntas. En un reactor tanque agitado con un único agitador, la mayoría de la transferencia de oxígeno tiene lugar en la zona del agitador. Scale down: los microorganismos pueden experimentar cambios continuamente cuando viajan a lo largo de un bioreactor grande, esto puede producir efectos indeseables. Para evitar estos problemas la escala grande se toma como un punto de referencia, y los efectos posibles se estudian por simulación de las variaciones sufridas en la escala grande en una escala experimental pequeña. Factores limitantes de la escala grande como transferencia de masa, se llevan a una escala menor, se estudian y se los minimiza de una forma práctica y económica. Hay algunas herramientas adecuadas para encontrar soluciones adecuadas al down – scaling: Se usan dos reactores imitando las dos zonas más importantes de un reactor, y la recirculación del caldo entre esas dos zonas. El tamaño de los compartimentos y la velocidad de recirculación son críticas, igual que el tipo de flujo en cada reactor. Por Ej. Se va desde un flujo bien mezclado a un flujo pistón.
El desarrollo y verificación en gran escala de modelos de flujo matemáticos para tanques grandes se llevan a cabo y luego se usan para diseñar el experimento en la escala menor. Se usan sistemas de ensayo microbianos bien caracterizados, en los cuales la sensibilidad a variaciones seleccionadas son conocidas. Esto se ha estudiado extensivamente para mejorar la transferencia de oxígeno y el mezclado del sustrato que se usa como alimentación en reactores grandes.
Transferencia de oxígeno gas – líquido Debido a la importancia de los procesos de fermentación aeróbicos, la transferencia de masa gas – líquido es casi un sinónimo de la transferencia de oxígeno desde las burbujas de gas a un medio líquido. Como la velocidad volumétrica de transferencia de masa es proporcional a la diferencia entre la concentración de equilibrio (saturación) c*0 y el valor real de la concentración de oxígeno disuelto en el medio c0, es necesario conocer la concentración de saturación. La solubilidad del oxígeno disminuye a medida que aumenta la temperatura, y disminuye con la concentración de varios solutos presentes en el medio. Solubilidad del oxígeno en agua pura a una presión de oxígeno de 1 atm
Solubilidad del oxígeno a 25 ºC a 1 atm de presión en varias soluciones acuosas
Métodos para la determinación del coeficiente volumétrico de transferencia de masa para el oxígeno Método directo: La mayoría de los procesos de fermentación aeróbicos están equipados con analizadores de oxígeno y electrodos para medir la concentración de oxígeno disuelto. Se mide el contenido de oxígeno a la entrada y a la salida junto con la velocidad de flujo del gas, si es posible se trabaja en condiciones de flujo estacionario y se determina la velocidad de transferencia de oxígeno volumétrico, qt0, el cual en ee es igual a la velocidad de consumo volumétrico –q0. Así tenemos la ecuación siguiente:
R: cte de los gases 8.314 J / mol ºK ó 0.08206 l atm / mol ºK, T (ºK), p0 es la presión parcial de oxígeno, y vg es la velocidad de flujo de gas. La mayoría de los analizadores dan el resultado como una fracción de moles de oxígeno en el gas. Cuando se usa aire normal, es suficiente analizar solamente la composición del gas a la salida. Sin embargo para bioreactores grandes es importante tener en cuenta la diferencia de presión a lo largo del reactor. Si se mide también la concentración de oxígeno disuelto, c0 en el medio, se puede calcular kla de:
Suposiciones La concentración de saturación c*0 es la misma a través del reactor. La diferencia de presión es pequeña y que la disminución en la presión parcial de oxígeno en la fase gaseosa es pequeña, si no es este el caso se debe usar la ecuación para la fuerza impulsora de la concentración: Este es un método simple y el que tiene una ventaja mayor para aplicarse en fermentaciones reales. Sin embargo se deben conocer medidas seguras del contenido de oxígeno, de las velocidades de flujo de gas y de la solubilidad del oxígeno en el medio. Además la tensión de oxígeno no debe cambiar durante la medida, ya que suponemos estado estacionario ó pseudo estacionario como un requerimiento estricto.
Método dinámico: se basa en la medida de la concentración de oxígeno disuelto en el medio. No requiere de medidas de la composición del gas, por lo tanto es un método barato. El balance de masa dinámico para la concentración de oxígeno disuelto es:
Si se corta el suministro de gas, qt0 es cero y el primer término del lado derecho de la ecuación cae a cero. La concentración de oxígeno disuelto disminuye a una velocidad igual a la velocidad de consumo de oxígeno, – q0 que puede por lo tanto determinarse midiendo la concentración de oxígeno disuelto c0 (t). Si q0 es independiente de c0 la concentración de oxígeno disuelto disminuye como una función lineal con el tiempo. Cuando se restablece el suministro de gas, la concentración de oxígeno disuelto aumenta de nuevo al nivel inicial, y usando el valor promedio estimado para q0, se puede determinar el valor de kla midiendo el perfil de oxígeno disuelto. El método es simple y puede aplicarse durante una fermentación real. Exige que q0 se determine correctamente cuando se corta el suministro de gas. La mayoría de los electrodos para medir la concentración de oxígeno disuelto, desafortunadamente tienen un tiempo de respuesta próximo al tiempo característico para el proceso de transferencia de masa, y por lo tanto las concentraciones medidas están influenciadas por la dinámica del aparato de medida, Ej un electrodo de oxígeno.
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