utilizando como fuente la hormona GNRH (fertagyl)
El objetivo principal del presente estudio es analizar la variabilidad de resultados al momento de la extracción de embriones en conejos, utilizando dos tratamientos, donde un grupo de conejas serán superovuladas y otra grupo será el control negativo, Los animales utilizados fueron 10 conejas de la raza Newzelad White (Nueva Zelanda Blanco), cinco fueron tratadas con la hormona y cinco como control negativo, siguiendo la aplicación de 0.2ml de la hormona GnRH (20m g, Fertagyl® intervet, México.) por la vía intramuscular, para posteriormente después de la aplicación las hembras fueron cubiertas por el macho, a las 48hrs. se procedió al sacrificio de las hembras, y extraer el tracto reproductor, se colocó en bolsas de plástico que contenían 350 ml. de PBS y someter los tractos a la extracción de los embriones, cada coneja que fue superovulada brindo más y mejor calidad en los embriones y además se determinó que la aplicación de Fertagyl sirve también como estimulante para la cópula pues las conejas
En la actualidad las técnicas de superovulación y extracción de embriones son cada vez más frecuentes en el área de la reproducción asistida, siendo México uno de los países que mas alejado esta de estos avances, teniendo un atraso biotecnológico de casi 8 años de las potencias europeas, por ello es importante de realizar estudios en materia de transgénesis y clonación animal, pero antes se debe impulsar las ciencias básicas de estos conocimientos de manera en que la extracción de embriones y fertilización in vitro sea común en el campo de la medicina veterinaria, así pues debemos estandarizar técnicas y protocolos para extracción de ovocitos, embriones, y fertilización in vitro, teniendo como experimentos principales los de mayor facilidad por economía y fácil manejo (Conejos, Hámster’s, Ratones etc.) además de que son especies politocas y se pueden recuperar en grandes cantidades y para después ser aplicados en especies mayores , Vacas, Yeguas, Borregas( monotocas) y debe ser menos los errores pues es más difícil su obtención y en menor número.
Las investigaciones han demostrado que las relaciones altas de LH: FSH afectan la capacidad del ovario para responder a los tratamientos con gonadotropinas exógenas.
El efecto de altos contenidos de LH en los preparados para superovulación, ha sido bien demostrado por Mapletoft y col. (1990) al incrementarse la dosis de preparados conteniendo LH en niveles por encima de los considerados óptimos. Estos produjeron un deterioro en la calidad de los embriones.
Estudios sobre situación de inducción a la superovulación con GnRH reportados por Escriba y col. (2001) demuestran que al ser inyectadas por vía intramuscular las conejas con GnRH (20m Fertagyl, Intervet, México) el tracto reproductor de la coneja responde con descargas de LH y FSH optimizando la maduración de los folículos y la liberación de los mismos y la calidad de los embriones se ve afectada mejorando los resultados de cantidad y calidad de los embriones.
Se cree que al aplicar GnRH accionaremos los mecanismos de liberación de LH y FSH con ello logra la inducción de la coneja a la producción y maduración de más óvulos de los que ya produce, así pues las conejas superovuladas aceptarán al macho por la cantidad de hormonas circulantes en su organismo, que han ejercido a la superovulación y la calidad de los embriones será superior en cantidad y calidad así como la eficiencia reproductiva de las conejas superovuladas.
Así también se pretende establecer una alternativa para las granjas para aumentar la producción de número de gazapos, apoyados en los estudios de fertilización y también el estudiar la mecánica de las biotecnologías reproductivas.
El objetivo consistió en determinar y comprobar que la GnRH es un método alternativo para la superovulación al ya establecido con PMSG así como el estudiar el mecanismo endocrino de la reproducción a la maduración de los folículos y realizar una constratastación entre los 2 tratamientos: superovuladas y el control negativo; y de los embriones recopilados se evaluarán para determinar la conveniencia de el tratamiento en calidad y cantidad, de embriones producidos por cada grupo de conejas, así como aprender el manejo de animales de laboratorio y sus aplicaciones en biotecnologías reproductivas como los tratamientos hormonales.
El presente trabajo se encuentra ubicado en el Sector cunícola de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, en las instalaciones de la posta Zootécnica, que se encuentra localizada en el municipio de Tarímbaro Michoacán la cual tiene la siguiente descripción.
Se localiza al norte del Estado, en las coordenadas 19º48' de latitud norte y 101º10' de longitud oeste, a una altura de 1,860 metros sobre el nivel del mar. Limita al norte con Copándaro y Cuitzeo, al este con Alvaro Obregón, al sur con Morelia y Charo, y al oeste con Chucándiro. Su distancia a la capital del Estado es de 12 kms.
Material biológico.
Los animales utilizados fueron 10 conejas de la raza Newzelad White (Nueva Zelanda Blanco), cinco fueron tratadas con la hormona y cinco como control negativo, las cuales fueron seleccionadas del sector cunícola del área de engorda, de acuerdo al cronograma de actividades establecido.
También se utilizaron sementales del sector para las cruzas de las conejas, los sementales son pertenecientes a las razas manejadas en el sector, se hace mención con más detalle en los cuadros del control de montas.
La hormona utilizada, para el protocolo de superovulación fue FERTAGYL® iNTERVET, MEXICo. La cual es un equivalente de la hormona de liberación de gonadotropinas (GnRH), y fue utilizada como tratamiento de superovulación en la especie cunícola.
Para la selección de las conejas a utilizar se requirió de 5 jaulas tipo americano con dimensiones de (90X60X40) propiedad del CMEB (Centro Multidisciplinarlo de Estudios en Biotecnología) para albergar a 2 conejas cada una de ellas, las cuales fueron flameadas y desinfectadas, así mismo los comederos de tolva y bebederos de chupón, para albergarlas posteriormente, fueron separadas necesitando de 5 jaulas más repitiendo el proceso de desinfección, y a las 2 semanas después se procedió a realizar el pesaje de las hembras, para determinar su madurez de acuerdo al peso, obteniéndose la 1era Tabla de pesos contenida en los anexos, para lo cual se requirió de una balanza de pesas perteneciente del sector, maraca OKEN, con capacidad para 20 kg.
El alimento suministrado a las conejas fue CONEJINA "N" el cual es perteneciente a la casa comercial purina. El 2do pesaje de las conejas se realizo de acuerdo cronograma de actividades, para determinar su madurez sexual de acuerdo al peso, y se dio el Vo. Bo para la segunda etapa del experimento. La cual consistió en la aplicación de 0.2ml de la hormona GnRH (20m g, Fertagyl® intervet, México.) por la vía intramuscular, para posteriormente después de la aplicación las hembras fueron cubiertas por el macho, se hicieron 2 tratamientos, cada uno de los cuales comprendían 5 conejas cada uno, además se repitió la monta, una monta a las 10:00 de la mañana, y una monta a las 5:00 de la tarde.
Después de las 48 hrs. de la monta se procedió al sacrificio de las hembras por el método de desnucamiento manual, para lo cual se requirió del equipo de matanza como cuchillos victorinox y chaira para afilar, se procedió al corte de la yugular y al corte de extremidades (posteriores y anteriores así como de la cola ), desprendimiento de la piel, se procedió la fractura de la zona pélvica, corte con escarpelo de los ligamentos sostentores del aparto reproductor, para de ahí se extraer el tracto reproductor, después del eviscerado se colocó en bolsas de plástico que contenían 350 ml. de PBS (Dulbecco’s Phosfate buffered saline, Sigma BioSciences) y se trasportaron al CMEB donde se continuo el proceso.
En el Centro Multidisciplinarlo de Estudios en Biotecnología apoyados por el Dr. Marco Cajero Juárez, se procedió a retirar el tejido adiposo, se requirió de Etanol al 70 %, mechero de busen, instrumental quirúrgico, del cual se hará una descripción de material utilizado: Tijeras de mayo, así como Tijeras de Metzenbaum, Pinzas de Rochester -Pean, Pinzas de Ochsner, Pinzas de Kelly, Pinzas de mosquito de Halsted y como la utilización de una campana de flujo laminal (LABNCO) y de cajas de petri ( SIGMA) para la remoción de los tejidos grasos.
El tracto reproductor fue tomado con las pinzas curvas de y con las pinzas de dientes de ratón y se removió el tejido con ayuda de las tijeras curvas, para después ser colocados en las cajas de petri, previamente llenadas con PBS (Dulbecco’s Phosfate buffered saline, Sigma Bio Sciences) y así se realizo la remoción se todos los tejidos.
Posteriormente en el área del quirófano, con ayuda de agujas Luer Lock 1.60 x 35 mm 15 Gx1x 1 / 3 sin punta, se hizo también un corte trasversal en los cuernos uterinos para después introducir una aguja y ser armada una jeringa con 5ml de PBS (Dulbecco’s Phosfate buffered saline, Sigma Bio Sciences) para el lavado canulado de los cuernos uterinos y al ser colectados en tubos falcón para ser centrifugados a 20 000 RPM LEC/ CENTRAL GP8 x 6:00 minutos a 10 º C y el sobrenadante (la fase acuosa) se tira y la pastilla se recupera y se resuspende en 25 ml de PBS (Dulbecco’s Phosfate buffered saline, Sigma Bio Sciences) y se centrifuga a 20 000 RPM x 6:00 minutos a 10 º C y el sobrenadante (la fase acuosa) se tira y la pastilla se recupera y se resuspende en 5 ml de PBS y se limpia con Hialuridaza (Bio Select), para romper las células del cúmulos de granulosa y observar en un microscopio invertido (ZEISS GERMANY), se evaluaron las cantidades y calidades de embriones de las hembras superoovuldas y no superovuladas, como se especifica en el área de Resultados.
Se procedió a congelar a los embriones con DMSO de (SIGMA BIOSCIENCES) y se congelaron en el ultra congelador REVCO .
Las expectativas del trabajo se cumplieron como se esperaban y los resultados se expresan de la manera siguiente:
EMBRIONES RECUPERADOS | |
No. Coneja | No. embriones |
1 | 38 |
2 | 35 |
3 | 33 |
4 | 39 |
5 | 36 |
6 | 20 |
7 | * |
8 | 17 |
9 | * |
10 | 16 |
Total | 234 |
* Conejas : no montadas pos signos de falsa gestación (inducida por ellas al contacto)
Cuadro No. 1 Número total de embriones por coneja, las primeros 5 fuerón tratdas con GnRH y las otras cinco como control.
Cada coneja que fue superovulada brindo más y mejor calidad en los embriones que se extrajeron denotándose la realidad entre los tratamientos utilizados, quedando comprobada nuestra hipótesis inicial que nos planteamos.
Como se pude observar el Cuadro No.1, la cantidad de embriones que nos dieron las hembras tratadas con Fertagyl. Se muestra y se confirma con la grafica 1.
Gráfica 1: Se muestran los dos tratamientos y su número en cada uno de los casos
* No produjeron embriones por que no aceptaron la monta del macho.
Con ello pues se observa la marcada diferencia entre el No. de embriones colectados de cada uno de los demás tratamientos.
Se determinó que la aplicación de Fertagyl sirve también como estimulante para la cópula pues las conejas que no aceptaban al macho en el primer intento después de ser inyectadas y transcurrido un lapso de tiempo 2 o 3 hrs. aceptaron la monta denotándose la coloración rojiza de la vulva, señal eminente de celo y aceptación al macho.
Se comprobó la hipótesis que se planteo que al inducir la superovulación con la GnRH se maduraron los folículos más pronto y en mayor número y por ende al momento de la ovulación la tasa de fertilidad aumentó considerablemente, pues los embriones recopilados con las hembras donde se aplicó el tratamiento fue mayor número y fueron de mejor calidad, al hacer una valoración de acuerdo a los revisiones literarias.
Concluyendo que la aplicación del tratamiento es buena cuando se requiera de mayor número de crías o bien para razas de baja prolificidad, como es el caso de las razas de producción de piel como lo es el Castor Rex.
Además de mejorar la fertilidad, las técnicas de superovulación, sincronización, recolección y congelamiento de embriones son las herramientas básicas de las biotecnologías reproductivas.
También se determinó que a parte de superovular a las conejas el tratamiento vuelve a las conejas aun más receptivas al momento del celo y aceptan la copula de 3 a 4 hrs. después de la aplicación de Fertagyl por vía intramuscular.
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BLANCA AURORA MARTINÉZ CORTÉS,
BERMUDEZ GÓMEZ LUIS EDUARDO,
LEDESMA TAFOLLA RIGOBERTO,
ROBLES SOLORIO ADRIAN,
HURTADO PINEDA ALEJANDRO,
SILVA SOLORZANO SILVIA,
ARIEL JIMENEZ TORES,
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA,
MARCO CAJERO JUÁREZ,
CENTRO MULTICIPLINARIO DE ESTUDIOS EN BIOTECNOLOGÍA
Yoshio Ivan Macswiney
UNIVERSIDAD MICHOACAN DE SAN NICOLAS DE HIDALGO,
Este artículo se realizó en la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo en la Facultada de Medicina Veterinaria y Zootecnia y fue presentado en la V jornada de investigación veterinaria de la Universidad.