Microscopía confocal

1. Características generales
2. Factores que influyen en la obtención de una buena imagen
3. Usos
4. Fluorocromos

• CARACTERISTICAS GENERALES1:

El Microscopio confocal, es un microscopio óptico que incorpora dos diafragmas: – un diafragma de iluminación localizado tras la fuente luminosa denominado Pinhole de Excitación, cuya utilidad es eliminar la luz proveniente de planos superiores e inferiores al plano focal, aumentando con ello la claridad y resolución de la imagen; y

– un diafragma de detección, de tamaño variable situado delante del fotodetector, denominado Pinhole de Emisión

 Manuel Reina , Univ. deBarcelona (http://www.ub.es/biocel/wbc/images/fluorescencia/clsm.jpg)

• Factores que influyen en la obtención de una buena imagen1:

• Alta precisión y velocidad en el barrido
• Pinhole continuamente variable
• Resolución hasta los 2048 x 2048 pixeles
• Controles independientes del PMT, amplificadores, filtros y configuraciones.
• Un detector y un pinhole por canal
• Un filtro optoacústico para el control de cada láser
• Disminución del ruido
• Escaneos seriados para la realización del objeto en 3D
• USOS:
• expresión y localización de moléculas en 2 o 3 dimensiones permitiendo reconstrucciones tridimensionales, tanto en cultivos celulares como tejidos histológicos;
• estudios de colocalización de proteínas u otro tipo de moléculas;
• transporte intracelular, endocitosis;
• medidas de concentraciones de iones intracelulares;
• desarrollo y expresión génica;
• hibridación in situ con sondas fluorescentes;
• FLUOROCROMOS2:

Los fluorocromos son sustancias que tienen la propiedad de emitir un fotón de una longitud de onda determinada cuando captan (son exitados) por un fotón incidente de una longitud de onda característica.

Uno de los problemas de la utilización de fluorocromos en microscopía de fluorescencia es la pérdida de ésta debido a las grandes intensidades de luz empleadas. Las muestras empleadas en esta técnica no pueden observadas durante largos periodos de tiempo debido a la desaparición de la fluorescencia ('fluorescence fading'). Se han desarrollado métodos que permiten reducir este efecto, entre ellos destacan :

• el uso de reactivos protectores de la fluorescencia ('antifading reagents')
• el uso de fluorocromos con poco 'fading'
• el empleo de luz de excitación de menor intensidad
• la reducción de la concentración de oxígeno en el especimen
• el direccionamiento del 100% de la luz hacia el dispositivo de registro (cámara, película,…) para reducir al máximo el tiempo de exposición.
• el empleo de mecanismos de medición de la exposición óptima (automática) para reducir la iluminación al máximo.

Los reactivos 'antifading' son moléculas que aportan al fluorocromo aquellos electrones que ha perdido por la emisión fluorescente. Se trata de moléculas donadoras de electrones que deben encontrarse para ser efectivas en estrecha vecindad a las moléculas de fluorocromo.

Los reactivos antifading más empleados son los siguientes :

• p-phenylenediamine. Es el reactivo más efectivo para la conservación de la fluorescencia de la fluoresceína (FITC). También efectivo para la rodamina. Se emplea al 0.1% en glicerol/PBS. El reactivo se tiñe de blanco cuando se expone a la luz. Se ha de conservar en la oscuridad. El contacto con la piel es extremadamente peligroso.
• DABCO (1,4-diazabiccyclo-2,2,2-octane). Muy efectivo para la fluoresceína, aunque menor que la p-phenylenediamine. Es menos sensible a la luz y es mucho menos tóxico.
• n-propyl galeate. Es el agente más efectivo para la rodamina, aunque también es efectivo para la fluoresceína. Se emplea al 0.1% en glicerol/PBS.
• 2-mercaptoethylamine. Se emplea para la observación de cromosomas y muestras de DNA teñinas con ioduro de propidio (PI), naranja de acridina (AO) o cromomysin A3. Se emplea al 0.1 mM en Tris-EDTA.
• Colorantes más utilizados – Rangos de emisión:

BIBLIOGRAFIA:

1. Presentación del Dr. Santa Coloma – Web page Carl Zeiss
2. Material docente diseñado y elaborado por Manuel Reina – Univ. de Barcelona
3. Centro Nacional de Biotecnologia (CNB – CSIC), Madrid – España

MARIANA PUCCIARELLI