Cromatografía liquida de alta performance

1. Métodos de separación

La cromatografía es una técnica que permite separar, aislar e identificar los componentes de una mezcla de compuestos químicos. La muestra es distribuida entre dos fases inmiscibles (sólida, líquida o gas) , una estacionaria y otra móvil, que se mueven una con respecto de la otra manteniendo un contacto íntimo, de tal forma que cada uno de los componentes de la mezcla es selectivamente retenido por la fase estacionaria. Los componentes de la mezcla a separar invierten un tiempo diferente en recorrer cada una de las fases, con lo que se produce la separación. Si un componente está la mayor parte del tiempo en la fase móvil el producto se mueve rápidamente, mientras que si se encuentra la mayor parte en la fase estacionaria, el producto queda retenido y su salida es mucho más lenta.

La separación se lleva a efecto en una columna tubular rellena de un sólido poroso finamente dividido, el cual puede actuar como fase estacionaria propiamente dicha como soporte de una fase estacionaria líquida. También se puede efectuar utilizando como fases estacionaria papel de filtro o un sólido finamente dividido colocado en forma de capa fina sobre una placa de vidrio. Estos tres tipos de cromatografía se basan en los mismos principios fundamentales, y se conocen respectivamente como cromatografía en columna, en papel y de capa fina. En ésta cromatografía solo se considerara la cromatografía en columna.

La cromatografía es un proceso de separación muy común en ingeniería química y bioquímica. Es un procedimiento altamente selectivo, capaz de distinguir y separar componentes con características físicas y químicas muy similares. Esta técnica se considera importante tanto a nivel de producción como de análisis. Desde el siglo pasado las separaciones analíticas se llevaban a cabo por métodos clásicos como son la precipitación, destilación y extracción. Los crecientes esfuerzos por conocer más sobre la composición y función de las proteínas han obligado a los científicos a buscar técnicas, cada vez, más precisas. Para elegir una técnica de separación, además de tener en cuenta los criterios económicos y de accesibilidad, hay que atender a dos tipos de consideraciones: unas tienen que ver con las propiedades físicas y estructurales de las moléculas que se pretende separar, o de las características de la matriz en que se encuentran; otras se derivan de los objetivos del análisis (sensibilidad, resolución, tiempo de análisis, necesidad de una detección específica). El método de selección incluye los pasos necesarios para la obtención, preparación y posible fraccionamiento de la muestra, la aplicación de la técnica analítica adecuada y el tratamiento de los datos obtenidos. Las técnicas analíticas más empleadas en la actualidad pueden englobarse en dos grandes grupos: técnicas de separación y técnicas espectroscópicas. Las técnicas espectroscópicas proporcionan, para cada compuesto analizado, una información compleja, relacionada con sus características estructurales específicas, por otro lado las técnicas de separación se utilizan para resolver los componentes de una mezcla y la señal obtenida puede utilizarse con fines analíticos cuantitativos o cualitativos. Actualmente las separaciones analíticas se realizan fundamentalmente por cromatografía y electroforesis.

La cromatografía no solo permite la separación de los componentes de una mezcla, sino también su identificación y cuantificación. Se pueden separar moléculas en función de sus cargas, tamaños y masas moleculares. También a través de la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox, etc. El análisis cualitativo está basado en la medida de parámetros cromatográficos (tiempos y volúmenes de retención) mientras que el análisis cuantitativo está basado en la medida de alturas o áreas de picos cromatográficos que se relacionan con la concentración. Los métodos cromatográficos se pueden clasificar según la forma en que la fase móvil y la fase estacionaria se pongan en contacto. Así en la cromatografía de columna, un tubo estrecho contiene la fase estacionaria a través de la cual se hace pasar la fase móvil por presión. En la cromatografía en plano, la fase estacionaria se fija sobre una placa plana o a los intersticios de un papel; en este caso la fase móvil se desplaza a través de la fase estacionaria por capilaridad o por gravedad. Las tres clases de cromatografía desde un ángulo más general son cromatografía de líquidos, cromatografía de gases y cromatografía de fluidos supercríticos. Como su nombre lo indica, la fase móvil en las tres técnicas son líquido, gas y fluido supercrítico respectivamente. En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija. Solo la cromatografía de líquidos es la que puede llevarse acabo en columna o sobre superficies planas, por otra parte tanto la de gas como la de fluidos supercríticos están restringidas a los procedimientos en columna de tal manera que las paredes de la columna contienen la fase móvil. La técnica más usada es la cromatografía líquida de alta resolución(HPLC), por su sensibilidad, fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles y su aplicación a sustancias de primordial interés en la industria, como son los aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, entre otros.

2.Tipos de cromatografía

En la cromatografía en columna, la fase móvil puede ser un líquido o un gas, y según el caso se denominan respectivamente"cromatografía líquida" y "cromatografía de gases ". Esta fase móvil fluye a través del relleno de la columna, arrastrando los componentes de la mezcla, que son selectivamente retenidos por al fase estacionaria. EL flujo de la fase móvil se mantiene constante a través de todo el proceso y de esta manera se logra que cada componente de la mezcla sea eluido de la columna como un compuesto puro, disuelto en la fase móvil. A esta técnica se le llama "cromatografía de elusión". De acuerdo con la naturaleza de las fases involucradas y con los mecanismos de separación, es posible distinguir diferentes tipos de cromatografía, como se indica en la figura 1.

FIG. 1 – Métodos cromatográficos. CGS: cromatografía gas-sólido; CGL: cromatografía gas-líquido; CLS: cromatografía líquido-sólido; CLL: cromatografía líquido-líquido; CFQU: cromatografía de fase químicamente unida; CII: cromatografía de intercambio iónico; CCF: cromatografía de capa fina; CP: cromatografía de papel; CE: cromatografía de exclusión; CPG: cromatografía de permeación en gel; CFG: cromatografía de filtración en gel.

Cromatografía de gases y cromatografía líquida de alta presión.

3. Cromatografía liquida "clásica" y cromatografía liquida de alta performance

La cromatografía liquida "clásica" se lleva acabo en una columna generalmente de vidrio, la cual esta rellena con la fase líquida. Luego de colocar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de la gravedad. Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual genero la necesidad de utilizar altas presión es para lograr que fluya la fase móvil. De esta manera, nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas. Ver figura 2.

4. Los métodos cromatográficos

Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenómeno físico que provoca la separación, la cromatografía líquida de alta resolución puede ser:

• 1) cromatografía de reparto o CLL: separa los solutos basándose en la solubilidad.

Formada por CLL y CFQU. Estas técnicas se diferencian en la forma en que se retiene la fase estacionaria sobre las partículas del soporte relleno. En el segundo caso, la fase estacionaria se une químicamente a la superficie del soporte. Esta técnica actualmente es más usada debido a que la cromatografía CLL necesita de un recubrimiento periódico de las partículas del soporte debido a la pérdida de la fase estacionaria por disolución en la fase móvil. En general, los soportes para casi todos los rellenos de fases unidas químicamente se preparan con sílice rígida o composiciones donde la sílice es el elemento básico. Estos sólidos están formados por partículas mecánicamente resistentes, porosas y uniformes. Los rellenos de columna en la CFQU se clasifican como de fase inversa cuando el recubrimiento enlazado tiene carácter no polar, y de fase normal cuando el recubrimiento contiene grupos funcionales polares.

Este mecanismo de separación se basa en la distinta solubilidad que presenta una molécula de la muestra en la fase móvil y en la fase estacionaria. De ahí que los compuestos mas solubles en la fase estacionaria sean selectivamente retenidos por ella en tanto que los menos solubles son transportados mas rápidamente por la fase móvil. Puede utilizarse en la separación de mezclas edulcorantes artificiales, antioxidantes, bebidas refrescantes entre otras.

El inconveniente de esta técnica es las solubilidad de la fase estacionaria en la fase móvil y el deterioro de la columna. Esto se puede corregir saturando la fase móvil con las fase estacionaria por medio de una precolumna que contenga un alto porcentaje de fase estacionaria. O bien, utilizando materiales que contengan la fase estacionaria químicamente unida a la superficie de un soporte (a modo de material de relleno de la columna no suele ser empleada); esto evita la perdida de fase estacionara y hace innecesario el uso de precolumnas para saturar la fase móvil.

Esta requiere un control cuidadoso de flujo y de la temperatura para poder identificar un compuesto de terminado en función del tiempo de retención que es característico, en las condiciones de flujo y temperaturas utilizadas, del compuesto determinado.

• 2) Cromatografía de fase químicamente unida (CFQU):

Esta técnica surgió como consecuencia de problemas asociados con la CLL. Dado que su fase estacionaria esta químicamente unida a la superficie de un soporte, la fase móvil difícilmente produce deterioro alguno en la columna. Si se varía la naturaleza de los grupos funcionales de las fase estacionaria es posible obtener diferentes tipos de selectividad. Dichos grupos pueden ser de naturaleza polar, como el grupo amino y el grupo nitrilo en el caso de la cromatografía de fase normal, o bien no polar como el grupo octilo, octadecilo, fenilo, etc. en el caso de la cromatografía de fase inversa, ésta tiene innumerables aplicaciones.

Su inconveniente es que en la cantidad de fase estacionaria que es posible unir a la superficie de un soporte (partículas de sílice), es limitada y como consecuencia los tamaños de muestra separados en esta columna son reducidos, por lo común menor de 1 mg.

Este mecanismo de separación es complejo, cuyas características son similares a la de la CLL y es el más utilizado. 3) Cromatografía de adsorción o CLS: se basa en la afinidad de adsorción Es la forma clásica de la cromatografía de líquidos. Ha sufrido algunas transformaciones que la han convertido en un método importante de la HPLC.

Las únicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografía son la sílice y la alúmina, siendo la primera la preferida.

Es adecuada para compuestos no polares probablemente con masas moleculares inferiores a 5000. Los métodos de la cromatografía de adsorción y reparto tienden a ser complementarios, aunque en algunos casos se superponen.

En general la CLS es más adecuada para muestras que son solubles en disolventes no polares y por ello tienen solubilidad limitada en disoluciones acuosas que son las que se utilizan en cromatografía de reparto en fase inversa. En éste tipo de cromatografía también se pueden separar compuestos con diferentes grupos funcionales. Una característica particular de este método es su capacidad para diferenciar compuestos isómeros en mezclas.

El mecanismo de separación de ésta, se basa en la competencia que existe entre las moléculas de la muestra y de la fase móvil o disolvente por ocupar los sitios activos en la superficie de un sólido (alúmina y gel de sílice).

Este tipo de cromatografía es muy útil y se aplica a moléculas de baja o media polaridad.

4) Cromatografía líquida por exclusión o CE: separa solutos según el peso molecular La cromatografía de exclusión, también llamada de filtración en gel o cromatografía de permeación en gel, se basa en la diferencia de penetración de las moléculas en los poros de la fase estacionaria debido a que la separación obtenida depende del tamaño de la molécula. El tiempo de retención es proporcional al peso molecular de los mismos, por lo que no es muy usada con los compuestos de alto peso molecular. Este tipo de separación por tamaño difiere de las demás técnicas de cromatografía en que no existen interacciones físicas o químicas entre el analito y la fase estacionaria. Es una técnica reproducible, escalable y rápida. La fase fija está formada por partículas de sílice que contienen una red uniforme de poros por los que pueden penetrar las moléculas de pequeño tamaño. Las moléculas de tamaño grande se excluyen totalmente y son eluidas en primer lugar, mientras que las de pequeño tamaño tienen acceso a todo el volumen poroso y son las últimas que se eluyen; de esto se deduce que el volúmen disponible para las moléculas pequeñas es mayor que para las grandes. Por lo tanto las moléculas se eluyen por su tamaño decreciente. Los diferentes tipos de partículas usadas deben ser estables: mecánica y químicamente; tener bajo contenido en grupos iónicos, uniformidad de poro y tamaño. Hay diferentes tamaños de partícula para un gel: a menor tamaño mayor resolución y menor gasto en la columna. Este técnica se emplea en la separación de proteínas de alimentos, determinación de glucosa y fructosa en zumos de fruta, etc.

La columna se rellena de un gel, cuyos poros son de tamaño similar al tamaño de las moléculas de la muestra. Las moléculas pequeñas pueden penetrar dichos poros y quedan retenidas en tanto que las grandes no. Las columnas empleadas pueden ser muy largas (varios metros) y esto es especialmente cierto cuando se desea separar muestras cuyos pesos moleculares están distribuidos en intervalos muy amplios.

Estas dos variantes en CE: la cromatografía de filtración, emplea materiales blandos; incapaces de resistir presiones mayores de 4 atm. y es muy aplicada en el estudio de los biopolímeros y en contraste; la cromatografía de permeación, emplea materiales de relleno semirígidos o rígidos, y que pueden resistir presiones muy elevadas. Ambas no implican mecanismos de separación diferentes y su división se debe a motivos puramente históricos.

Aunque existen excepciones, la eficacia de las columnas de la CE es por lo general relativamente baja, por lo cual no es frecuente en esta técnica obtener la separación de compuestos individuales, sino más bien fracciones de un cierto intervalo de pesos moleculares. El mecanismo de separación es tal que el tiempo de retención es inversamente proporcional al volúmen de las moléculas en la fase móvil y por lo tanto proporcional al peso molecular; las moléculas más pequeñas son las que son objeto de una mayor retención en la columna.

5) Cromatografía por intercambio iónico o CII: Separa solutos según la carga iónica. Está basada en la atracción entre iones del soluto y puntos cargados que existen en la fase estacionaria. En el caso de intercambiadores aniónicos, grupos cargados positivamente en la fase estacionaria atraen aniones del soluto. Los intercambiadores catiónicos contienen puntos cargados negativamente que atraen cationes del soluto.

Los intercambiadores iónicos se clasifican en ácidos o básicos, fuertes o débiles. Las resinas ácidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones muy ácidas, en cambio las resinas ácidas débiles se protonan a un pH próximo a 4 y pierden su capacidad de intercambio catiónico. Los grupos muy básicos de amonio cuaternario siguen siendo catiónicos a cualquier valor de pH. Los básicos débiles de amonio terciario se desprotonan en disoluciones moderadamente básicas y pierden entonces su capacidad. Las resinas de intercambio iónico tienen aplicación de estudios donde intervienen moléculas pequeñas (PM = 500) que pueden penetrar en los poros pequeños de la resina. Los intercambiadores iónicos de políestíreno son tan grandes que en las macromoléculas muy cargadas, como las proteínas, se pueden lanzar irreversiblemente a ellos. Los de celulosa y dextranos sirven para intercambio iónico de macromoléculas. Los geles de intercambio iónico se usan en el caso de moléculas grandes (proteínas y ácidos nucleicos). Cuando las separaciones exigen condiciones químicas fuertes se emplean intercambiadores iónicos inorgánicos.

La separación por intercambio iónico se basa en la competencia entre la fase móvil y la muestra iónica por los sitios o grupos activos de una resina intercambiadora de iones.

Este tipo de separación se aplica a compuestos de un intervalo de pesos moleculares muy amplio, y ejemplos característicos de éstos son los péptidos y los aminoácidos. Las columnas son más largas que las empleadas en otro tipo de cromatografía se basa en la baja eficiencia de los materiales intercambiadores de iones. La gran variabilidad de los métodos cromatográficos se debe a las diferentes condiciones que pueden utilizarse para separar los componentes de una sustancia. Todas estas técnicas tienen en común la existencia de una fase estacionaria a través de la cual fluye una fase móvil, así como la presencia de un mecanismo de inyección de la muestra y un mecanismo de detección de los diferentes componentes separados

4. Ventajas y desventajas de la cromatografía líquida de alta presión

Ventajas Desventajas –Velocidad de análisis –Instrumentación costosa -Alta resolución -Difícil análisis cualitativo -Resultados cuantitativos -No existe detector universal -Buena sensibilidad y sensible –Automatización -Elevado costo de operación -Amplio espectro de aplicaciones -Experiencia indispensable Con esta técnica es usual obtener separaciones en minutos e inclusive en algunos casos en segundos. Por lo tanto se requieren columnas de alta eficacia y sistemas de bombeo de alta presión, ya que separaciones rápidas requieren flujos rápidos de fase móvil y esto a su ves requiere presiones elevadas.

Su alta resolución permite obtener y separar mezclas muy complejas; como algunos fluidos biológicos como la orina humana. Las muestras naturales son difíciles de manejar, pero con CII y programación de fase inmóvil la resolución es notable.

Los métodos de HPLC proporcionan muy buena información de tipo cualitativo, efectuando análisis con precisión del 1%.

Los detectores proporcionan buena sensibilidad y según el tipo de muestra suelen medir hasta los 10 ng (nanogramos), otros mas especializados pueden detectar cantidades muy pequeñas.

Entre las ventajas de esta técnica, la más importante es la diversidad de sus aplicaciones tantos a compuestos orgánicos como inorgánicos, etc. Las únicas muestras no susceptibles de poderse analizar con facilidad son las gaseosas. Mediante los instrumentos cromatográficos, la identificación de cada señal de la muestra a análisis se realiza comparando los tiempos de retención con valores previamente determinados y la cuantificación se obtiene mediante las áreas integradas de las señales de acuerdo con el método analítico seleccionado.

Teniendo en cuenta sus limitaciones, el instrumental es costoso y representa inversión para los laboratorios. Otra limitación es la necesidad de que el personal que utiliza estos métodos tenga experiencia para poder obtener provecho, lo cual requiere de 6 a 12 meses de experiencias para llegar a ser operador eficiente. La HPLC no es un buen método de identificación, en general la cromatografía es básicamente una técnica de separación de gran resolución, pero que no nos identifica el compuesto que da la señal obtenida en el cromatograma.

5. Instrumental

La HPLC utiliza un instrumental con ventajas significativas:

En este método se usan columnas de diámetros muy reducido, rellenas de materiales especiales pulverulentos, cuyas partículas tienen un tamaño entre 30-40 m y con frecuencia hasta de 5 ó 6 m , con una distribución de 2m . Este tipo de columna es muy eficaz, pero ofrece una gran resistencia al flujo de la fase móvil, o sea una gran caída de presión. Por lo que se emplean sistemas de bombeo de alta presión que hagan fluir la fase móvil a velocidad a través de la columna. La cantidad de fase estacionaria dentro de la columna es pequeña, por lo tanto la muestra debe ser pequeña en 1 y 10 mg.

Si la presión de entrada a la columna no es muy elevada, la muestra se introduce en la cámara de inyección mediante una jeringa de alta presión, a presiones más elevadas se utilizan las válvulas de inyección. La columna a pesar de su repetido uso, presenta un escaso deterioro, auque en algunos casos es necesario regenerarla.

Un detector colocado a la salida de la columna, proporciona un registro continuo de la composición del líquido que sale, lo que permite obtener un cromatograma y que se utiliza para identificar y cuantificar los componentes de la muestra.

6. Aplicaciones

La cromatografía líquida de alta presión a pesar de ser una técnica relativamente nueva, se cuenta que describe numerosas aplicaciones en la literatura química. En la mayoría de los casos, éstas consisten en determinaciones de sustancias cuyo análisis por otra técnica cromatográfica resulta muy difícil. Estos resultados comprenden:

• Compuestos iónicos, como aminoácidos, sales inorgánicas, ácidos orgánicos, etc.

• Compuestos de alto peso molecular, como polímeros, hidrocarburos polinucleares, productos naturales, etc.

• Compuestos termolábiles y no volátiles, como vitaminas, pesticidas, esteroides, plastificantes, drogas y un producto muy grande de otros productos farmacéuticos.

En los problemas relacionados con la contaminación ambiental, la HPLC se utiliza para la contaminación de algunos pesticidas (insecticidas, larvicidas, hervicidas, etc.). También es posible la determinación de hidrocarburos aromáticos polinucleares que son contaminantes atmosféricos muy importantes En cromatografía líquida el análisis de compuestos vitamínicos es posible en corto tiempo.

El bioquímico con frecuencia en un campo de investigación es el que plantea el problema de analizar compuestos volátiles y de alto peso molécula. Por ejemplo, se han efectuado determinaciones de constituyentes de ácidos nucleicos (nucleótidos, nucleósidos) por cromatografía de intercambio iónico.

En el campo bioquímico la determinación de esteroides en cromatografía líquida ha sido el de detección, ya que sólo el detector de luz ultravioleta es lo bastante sensible para poner de manifiesto estos compuestos a bajas concentraciones, pero no todos los esteroides absorben en la región ultravioleta. Esto ha dado lugar a la formación de compuestos derivados de los esteroides que absorben en el ultravioleta a fin de hacer posible el análisis.

El análisis de medicamentos es también una aplicación muy interesante, la determinación de los componentes activos de una tableta analgésica. También el análisis de barbitúricos, anticonceptivos, etc.

En caso de que el compuesto analizar sean de alto peso molecular, se usa cromatografía de permeación o de exclusión. Es posible combinar dos o más técnicas cromatográficas para efectuar separaciones difíciles. La de permeación es útil en el estudio de polímeros, facilitando la determinación de la distribución de pesos moleculares, y en la investigación de productos naturales para efectuar separaciones de acuerdo con el peso molecular.

En separaciones según el tipo químico su finalidad no es la separación de compuestos individuales, sino de grupos diferentes de sustancias presentes en las mezcla. 9. Bibliografía * Harold M. McNair y Benjamín Esquivel H. Departamet of Chemistry y Virginia Polytechnic Institute and State University Blacksburg, Virginia Estados Unidos, 2ª edición 1980. * Principios de Análisis Instrumental 5ª Edición. Skoog Holler Nieman.

* Información de internet (www.quiored.com.ar, www.tecnoedu.com, Red Latinoamericana de Química por: Rubén Darío Cortez)

CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA PERFORMANCE AUTORAS

Enviado por: Ing.+Lic. Yunior Andrés Castillo S.

"NO A LA CULTURA DEL SECRETO, SI A LA LIBERTAD DE INFORMACION"®

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Santiago de los Caballeros, República Dominicana, 2015.

"DIOS, JUAN PABLO DUARTE Y JUAN BOSCH – POR SIEMPRE"®

Autor:

Cristina Soledad Beck.

Ariana Ibarra.