Metabolito bacteriano a partir de Burkholderia cepacia como agente biocontrolador en cultivos de interés agrícola (página 2)

4. CARACTERÍSTICAS MÁS IMPORTANTES DE LA ESPECIE Pseudomonas (Burkholderia) cepacia.

El género Pseudomonas presenta un amplio espectro nutricional y no requiere de factores de crecimiento para su desarrollo. Así se ha encontrado como un género dominante en la rizosfera del maíz en diferentes localidades edafoclimáticas (Hebber,1999). También aparecen poblaciones altas en la rizosfera de las plantas de trigo y plantas ornamentales (Hernández, 2000).

Pseudomonas (Burkholderia) cepacia tiene una alta frecuencia de aparición, en la mayoría de los casos estudiados (Hernández, 1998). En los últimos años, esta especie adquiere vital importancia en estudios relacionados con la agricultura, debido fundamentalmente a la producción de una amplia gama de metabolitos activos que influyen positivamente sobre el crecimiento y desarrollo saludable de las plantas.

Se caracteriza por ser bacilos cortos Gram negativo, mótiles y no formadoras de esporas, produce pigmentos no fluorescentes difusibles en el agar (piocinina) y acumula gránulos de poli -b hidroxibutirato (PHB). Es lecitinasa, ureasa, lisina descarboxilasa y amilasa negativa. Puede ser gelatinasa positiva o negativa (Pallerony, 1984).

Existen cepas patogénicas y saprofiticas, dado fundamentalmente por su gran diversidad genética. De aquí la importancia, de trabajar con su parte activa, es decir con los metabolitos secundarios que al parecer son los responsables de los efectos benéficos en plantas por lo que al eliminar la célula se evita cualquier problema de índole ecológico. Esta especie produce diferentes tipos de sideróforos (Meyer et al., 1989) y ácido indol acético.

5. CONDICIONES DE CRECIMIENTO MICROBIANO.

La composición de los medios de cultivos para la multiplicación de B. cepacia, se informa en general en la literatura especializada, los de mayor frecuencia reportados son King A, King B (King y Rang, 1954) en medio liquido, sin embargo se reportan otros para su empleo en mayores volúmenes dependiendo de la utilidad final que se requiera (Ortiz et,al 2000; Sánchez et al., 2003). Su temperatura óptima de crecimiento es 37± 30C, se desarrollan a un pH 7.2± 0.2. Tienen un crecimiento rápido tanto en medio agitado como estático (Miranda, 1998).

En estudios con metabolitos secundarios se debe tener en cuenta que los mismos se producen durante la fase estacionaria de crecimiento y su producción esta en dependencia de las condiciones de cultivo, por lo que los compuestos fermentativos relacionados con uno u otro metabolito resultan complejos y se pueden observar variaciones en la concentración de los mismos, aún cuando se mantengan las mismas condiciones de fermentación, a diferencia de los procesos donde se persigue la obtención de biomasa de un microorganismo determinado, la cual no está sometida directamente a las complejidades de las rutas metabólicas y sus respectivas regulaciones (Fernández, 1998).

6. MECANISMOS DE ACCIÓN. CONTROL BIOLÓGICO DE PATÓGENO.

El uso de antagonistas microbianos para el control de fitopatógenos se ha catalogado como un importante complemento en el manejo integrado de las enfermedades de las plantas. El género Pseudomonas,presenta propiedades que lo ubican dentro de las PGPR como agentes de biocontrol, debido a que las bacterias de este grupo tienen la capacidad de crecer colonizando los órganos de las plantas tales como raíces y tubérculos, utilizan un gran número de sustratos orgánicos comúnmente encontrados en exudados radicales y producen una gran variedad de metabolitos secundarios tóxicos a hongos y bacterias fitopatógenos, entre los cuales se destacan los sideróforos, los antibióticos y los alcaloides quinolisidínicos (Hernández et al., 1999).

El modo de acción de Pseudomonas sp incluye la inhibición del patógeno por competición por el hierro III (hipótesis de los sideróforos) o por productos volátiles o difusibles (antibiosis) y la inducción de resistencia en plantas (Meyer, 1999).

Pseudomonas (Burkholderia) cepacia se destaca por producir diferentes tipos de sideróforos, antibióticos, alcaloides quinolisídinicos de naturaleza antibiótica (Hernández, 1999), ácido cianhídrico y ácido salicílico . En los últimos años se ha prestado especial interés a los sideróforos, como uno de los principales metabolitos implicados en la actividad de biocontrol.

7. SIDEROFÓROS: palabra griega que significa portador de hierro.

Los sideróforos son pigmentos extracelulares fluorescentes con alta afinidad por el hierro III (Kfe > 1030,) de color amarillo verdoso, solubles en agua y de bajo peso molecular (500-1000 Da) (Dybas et al, 1995), producidos por una gran variedad de microorganismos crecidos en condiciones de hierro limitante.

La hipótesis de los sideróforos, plantea que estos suprimen la enfermedad mediante el secuestro de hierro III convirtiéndose así este elemento en un factor limitante para el crecimiento de patógenos en la rizosfera (Schroth y Hancock, 1982). Cuando el sideróforos forma el complejo con el hierro, este último se hace inaccesible para los microorganismos patógenos, los cuales no poseen los receptores proteicos específicos para adquirir el hierro enlazado. Por otro lado, las bacterias productoras de este metabolito, poseen un sistema de transporte y un receptor de membrana específico, que reconocen el complejo sideróforo– hierro III, por lo cual se considera que estos sirven como vehículo de este elemento hacia el interior de la célula bacteriana (Xiao and Kasaalita, 1995).

Las plantas por su parte han desarrollado diferentes estrategias por ejemplo liberación de protones o la excreción de agentes reductores para poder incluirlos en su propia nutrición (Chen, 1995).

Virtualmente todos los microorganismos (excepto lactobacillus) requieren de hierro para satisfacer sus necesidades vitales, pues éste participa en procesos biológicos tan importantes como el transporte de oxígeno, síntesis del DNA, fijación del nitrógeno, fotosíntesis y respiración (Venturi, 1994).

En estos procesos el hierro participa como cofactor de muchas enzimas del metabolismo y proteínas reguladoras al poder existir en dos estados de oxidación, (Fe2+) y férrico (Fe3+) (Venturi et al 1995). Sin embargo, este elemento no siempre esta disponible para ser aprovechado por las bacterias, debido a que en el medio ambiente, el oxígeno atmosférico produce la oxidación del Fe2+ a Fe3+, precipitado este último como hidróxido férico que no es biológicamente accesible para los microorganismos debido a su baja constante de solubilidad (Venturi, 1994). Este fenómeno se acentúa en suelos neutros y alcalinos (Alexander y Zuberer, 1991).

Con el objetivo de tratar de dilucidar las propiedades de los sideróforos se han realizado varios ensayos, como estos metabolitos son utilizados por las bacterias que los producen y la influencia que tienen su producción sobre las plantas.

Uno de los aspectos que ha sido estudiado es su actividad enlazadora con el hierro marcado. Esta se demostró a través de la capacidad mostrada por los sideróforos en arrastrar hierro marcado radioactivamente a través de una columna de Sephadex G-25, luego de haber comprobado que el hierro era incapaz de eluir en ausencia de sideróforos bajo las mismas condiciones de corrida y elución (Yang et al; 1991).

Con relación al papel en la asimilación del hierro por parte de la célula, se han realizado bioensayos donde se comprueba que el sideróforo es capaz de acoplarse al hierro para introducirlo en la bacteria.

8. ESTRUCTURA

Estructuralmente están formados por un cromóforo fluorescente enlazado a una cadena peptídica y difieren fundamentalmente en el tamaño y composición de la misma (Xiao and Kasaalita, 1995).

El factor estructural común de los sideróforos es el cromóforo fluorescente que ha sido identificado como 2,3 diamino-6,7 dihidroxiquinolina y su grupo o-dihidroxiaromático que se encarga de enlazar el hierro (Demage et al; 1986).

Pseudomonas (Burkholderia) cepacia produce diferentes tipos de sideróforos: piochelin (Sokol, 1986), cepabactin (Meyer et al; 1989), ornibactin (Meyer et al; 1995), cepaciachelin (Barelmann et al, 1996) y ácido salicílico y tiene demostrado su papel rector en el biocontrol de hongos fitopatógenos que provocan enfermedades en diferentes cultivos de interés agrícola

9. PRODUCCIÓN DE SIDERÓFOROS A PARTIR DE B. cepacia

Los sideróforos para su producción necesitan de medios con bajo contenido de hierro y un pH entre 7-7,2 (Bahame and Schorth, 1989).

Para la mayoría de las Pseudomonas, la temperatura óptima para la producción de este metabolito se encuentra entre 28 y 37 °C. Sin embargo, Bahame y Schorth, (1989) plantean que para algunas especies de este género esta producción se inhibe a temperaturas mayores de 33°C.

Los medios de cultivos empleados para la producción de cantidades suficientes de sideróforos deben ser líquidos, pues facilitan la recuperación del producto una vez concluida la fermentación, debiendo garantizar que su composición contenga bajas concentraciones de hierro (Miranda, 1998). Esté cultivo puede realizarse en condiciones de agitación o estático. En medio king B, utilizando ambas condiciones el compuesto apareció durante la fase estacionaría de crecimiento, mostrándose como un metabolito secundario no asociado al crecimiento (Hernández et al, 1999).

La producción de sideróforos a partir de B. cepacia se obtiene mediante fermentación y para ello se han utilizados fermentadores de 7 L nivel de banco evaluando diferentes velocidades de agitación sobre el crecimiento de B. cepacia 0057, así como la producción de sideróforos (Figura 1; Tabla 1) con el medio de cultivo King B (King y Rang, 1954) estos resultados coinciden con otros medios reportados por Ortiz et.al 2000, quienes encontraron que medios con sirope fructuosa son capaces de estimular la producción de metabolitos secundarios como los sideróforos

Hay que destacar que se obtuvo como resultado un incremento en la velocidad específica de crecimiento y en la producción de sideróforos respecto a los cultivos desarrollados a nivel de zaranda orbital por Sánchez et.al., 2003, debido probablemente a los niveles de agitación empleados y la aireación, favoreciendo así la multiplicación microbiana. No obstante, el incremento en los niveles de agitación no afectó ni los valores de la constante de velocidad ni el rendimiento celular por los valores máximos de células viables obtenidas (que fueron de 6,8 x 1010 , 4,5 x 1011 y 5,6 x 1011 UFC/mL para 100, 150 y 200 rpm respectivamente ya que no se hallaron diferencias significativas entre dichos valores.

En cuanto a la producción de sideróforos (Tabla 1) se observa que a las 18 horas de incubación hay mayor contenido de metabolitos (sideróforos) en todas las condiciones evaluadas. Sin embargo cuando se compararon entre sí hay una mayor estimulación de producción de sideróforos a 150 rpm, existiendo diferencias significativas (P<0.05) entre esta, y las restantes velocidades de agitación evaluadas.

Tabla 1. Producción de sideróforos mediante fermentación con diferentes velocidades de agitación.

Cuando se realizó un análisis de regresión múltiple donde la variable dependiente fue contenido de sideróforos y la variable independiente fue la agitación, se obtuvo que dicha variable fue significativa con el siguiente modelo:

Por lo que el modelo fue válido dado el coeficiente de correlación.

Con estos resultados se pudo determinar analíticamente que la velocidad de agitación máxima es de 158 rpm para obtener los mejores niveles de producción de sideróforos en la región estudiada, resultados que se corroboraron en la experimentación al obtener a las 18 horas mayores rendimientos de sideróforos (D.O.=40±0,05) en tres corridas realizadas. Con estas condiciones se procedió a obtener sideróforos y evaluar su efecto biológico "in vivo" e "in vitro" ante Phytophtora infestans, demostrando el papel de estos metabolitos en el control del hongo fitopatógeno (Miranda et al., 2000).

8. IMPORTANCIA DE LOS BIOPREPARADOS DE ORIGEN BACTERIANO EN DIFERENTES CULTIVOS DE INTERÉS AGRÍCOLA.

En Cuba en los últimos años se ha favorecido el desarrollo de numerosos trabajos de búsqueda, selección y aplicación de bacterias con propiedades beneficiosas a las plantas, surgiendo así biopreparados a partir de bacterias de los géneros Azospirillum (Velazco y Fernández, 1992; Fernández, 1995), Azotobacter (Dibut 2000) y Pseudomonas (Hernández, 2000). Estos productos unidos a los obtenidos a partir de hongos micorrizógenos se han convertido en un importante renglón de investigaciones y de aplicación de microorganismos en la agricultura

Así, se ha demostrado la efectividad de los metabolitos activos de B. cepacia en la micropropagación y adaptación de plantas de cafeto, se logra con el mismo sustituir las hormonas del medio de cultivo y estimular el crecimiento vegetal

En papa se ha informado el efecto antagónico, de biopreparados a partir de cepas de Pseudomonas, contra Phytophtora infestans. En plantas ornamentales, también se ha corroborado el efecto benéfico de los mismos (Cortés, 1999). Meyer et al., 1995 informaron la actividad antagónica de sideróforos producidos por cepas de B. vietnamiensis y B. cepacia contra varios hongos fitopatógenos, tales como Rhizoctonia, Heliminthosporium, Fusrium y Pitium

Asimismo, Maurhofer et al, 1992 demostró que la cepa CHAO de P. fluorescens controlaba varias enfermedades en plantas mediante la producción de pyoluteorin y 2,4 diacetylfloroglucinol, ejemplo Pitium ultimatum en pepino. Por otro lado, se ha demostrado que cepas de B. cepacia controlan el ataque de Fusarium al maíz y plantas hornamentales (Hebbar et al, 1992; 1998)

En los cultivos de gladiolos blancos sanos e infectados con Fusarium sp se pudo constatar el efecto bioestimulador y biocontrolador de biopreparados basados en sideróforos obtenidos bajo estas mismas condiciones. Se realizó un experimento donde este biopreparado se formuló sobre un soporte sólido, conteniendo el extracto crudo según la metodología descrita por Hernández (1998). La germinación de las semillas inoculadas con este biopreparado tanto sanas como infectadas lograron salir del período de dormancia primero que el control sin inocular (Tabla 2).

Tabla 2. Efecto sobre la germinación.

En el caso del control con semillas infectadas, solo logra germinar el 6.66 %, pereciendo al cabo de los diez días. Resultados similares encontró Álvarez et al, 2000 quien demuestra que cuando hay ataque de Fusarium en el cultivo del gladiolo se afecta la germinación de la semilla y la posterior aparición de la espiga.

Por otro lado se ha demostrado el efecto bioestimulador de este bioperarado sobre otros parámetros fisiológico del cultivo como es el caso de la altura Hernández 1995, al inocular plantas de maíz con biopreparados a base de cepa de Pseudomonas. Pazos (2000) encontró incrementos en los parámetros al tratar plantas de arroz con cepas nativas de Azospirillum brasilense. Al parecer existe una relación directa entre la altura y las variables de la espiga, numero de flores y corno por planta para cada tratamiento. En todos los casos se destacan los tratamientos donde se aplicó el producto, no mostrando diferencias entre semillas sanas e infectadas representado en la figura 3

Experimentos "in vitro" e "in vivo" han demostrado que los sideróforos desempeñan un importante papel en el biocontrol de diferentes hongos fitopatógenos que atacan a cultivos de interés económico. Los resultados obtenidos en este experimento demuestran el efecto biocontrolador del biopreparado estudiado, que incluye sideróforos, ante Fusarium sp.

No obstante, se debe continuar los estudios del efecto de este biopreparado empleando sideróforos y otros metabolitos bacterianos con vista a esclarecer aún más su papel en el biocontrol ante agentes patógenos de aquellos cultivos de gran interés agrícola, por lo que abre nuevas alternativas en la producción de estos tipo de biopreparados de origen bacteriano toda una vez que se establezca la producción de estos componente de una forma consistente.

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Autor:

Lilian Sánchez*

Annia Hernández**

Sucel Ortiz**

*Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria ( CENSA)

* Instituto nacional de ciencias agrícolas

Grupo Desarrollo.

Dirección de producciones Biofarmacéuticas

Cuba.