Evaluación diagnóstica de fracciones cromatográficas de Fasciola hepatica mediante Western Blot y ELISA en animales infectados

• Introducción
• Material y métodos
• Resultados y discusión
• Bibliografía

RESUMEN: La fasciolosis causada por Fasciola hepatica se diagnostica rutinariamente mediante el examen coprológico. Debido a que este examen no es 100% sensible y además es ineficaz en la etapa pre-patente, se realizó este trabajo con el objeto de caracterizar y seleccionar fracciones antigénicas de valor diagnóstico de extractos de excreción-secreción del parásito.

Se utilizó cromatografía de exclusión por tamaño molecular (Sephacryl S-300), electroforesis en geles de poliacrilamida en ambiente reductor (SDS-PAGE) y posterior western blot (WB), además de un método de "enzyme-linked immuno-sor-bent assay" (ELISA) en microplaca. Para evaluar el valor diagnóstico de los antígenos se usaron sueros de las especies ovina, porcina y equina en tres estados (sanos, con otras parasitosis y naturalmente infectados con F. hepatica).

Mediante el método cromatográfico se obtuvieron hasta 5 "peaks", que interpolados en una curva patrón representaron polipéptidos de pesos aproximados de 2.000, 400, 150, 29 y menores a 29 kDa. De éstos, los inmunorreactivos específicos para la enfermedad en las tres especies animales, bajo los criterios de SDS-PAGE y posterior WB, fueron los de 400, 150, 29 y <29.

La evaluación mediante ELISA en microplaca, de estas fracciones con los sueros de las tres especies animales infectadas, indicó que la fracción de 29 kDa ofreció valores de sensibilidad y especificidad de 94.5% y 93.5%, respectivamente. Similares valores de sensibilidad y especificidad se determinaron al enfrentar esta fracción antigénica con sueros de ovinos en la etapa prepatente de la infección. Esta misma fracción analizada por el criterio de SDS-PAGE y luego por WB dio dos bandas de reconocimiento específico, una de 29 kDa y otra de 14 kDa aproximados. Con estos resultados concluimos que la fracción cromatográfica de 29 kDa sería capaz de discriminar en las especies ovina, porcina y equina, entre aquellos animales sanos, con otras parasitosis y con fasciolosis. Además fue también eficiente para diagnosticar la infección en etapa prepatente en ovinos. Por ello se constituye en una fracción promisoria para ser purificada y empleada en estudios epidemiológicos mediante ELISA.

Palabras claves: fasciolosis, diagnóstico, SDS-PAGE, Western Blot, ELISA.

SUMMARY: Diagnostic evaluation of chromatographic fractions of Fasciola hepatica by Western Blot and ELISA in infected animals

The antigenic components of excretory-secretory products of adult F. hepatica, were separated by gel filtration chromatography (Sephacryl S-300) and then analized by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), followed by Western Blot (WB). In order to evaluate the sensitivity, specificity and predictive value of the selected fractions an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used with sera from sheep, swine and horses infected with F. hepatica, as well as with control sera (uninfected animals).

The chromatographic curve presented up to 5 peaks, representing polypeptides with a molecular weight of 2000, 400, 150, 29 and less than 29 kDa, according to the interpolation with a standard curve of commercial polypeptide molecular weights. The results obtained with SDS-PAGE and WB using sera from the three species, indicated that those fractions of 400, 150, 29 and <29 kDa contained polypeptides, specifically recognized only by infected animals. When these fractions were evaluated with sheep, horse and swine sera by means of ELISA, the most efficient fraction was the 29 kDa, exhibiting an average sensitivity and specificity of 94.5% and 93.5%, respectively in the three species. The SDS-PAGE and WB assay of this fraction showed the presence of two immunoreactive bands, a 29 kDa and another of 14 kDa.

According to these results, it is concluded that the polypeptides contained in the 29 kDa chromatographic fraction would be suitable specific antigens, since they discriminate between infected and non infected F. hepatica animals. This fraction was also efficient in diagnosing fasciolosis in the prepatent stage of the infection in sheep. Therefore this fraction should be further studied and purified as it constitutes a prominent immunodiagnostic fraction which may be used for mass screening studies of fasciolosis using an ELISA test.

Key words: fasciolosis, diagnosis, SDS-PAGE, Western Blot, ELISA.

INTRODUCCION

La fasciolosis en Chile ha desplazado a la hidatidosis como la zoonosis de mayor prevalencia en los animales de abasto beneficiados en los mataderos controlados por los servicios de salud. Su agente etiológico, Fasciola hepatica, es el único tremátodo de importancia médico-veterinaria y de salud pública en nuestro país.

La infección por el parásito se presenta a lo largo de todo el territorio nacional, con la sola excepción de la XII Región. Las zonas más afectadas son las ubicadas entre la IV y X Regiones (Chile, 1989).

La mayor importancia de esta parasitosis radica fundamentalmente en que reduce la productividad de los animales. Así por ejemplo, se ha estimado que un animal puede producir menos carne debido a que consume en promedio un 15% menos de alimento (Ferre y col., 1994).

El examen coprológico se utiliza rutinariamen- te en los animales como método diagnóstico, sin embargo, no logra detectar el 100% de los casos infectados (Gorman y col., 1991). Además, no es útil para diagnosticar la etapa prepatente de la infección (fase aguda), ya que los parásitos por ser inmaduros no producen huevos (Zimmerman y col., 1982). Otro procedimiento diagnóstico, pero inespecífico, es la medición de enzimas celulares tales como son la transaminasa glutámica oxalacética, la aspartato aminotransferasa y la sorbitol dehidrogenasa, cuyos niveles aumentan en el período prepatente de la infección, pudiendo dar una evidencia circunstancial y no específica sobre la presencia de F. hepatica (Sykes y col., 1980; Hawkins, 1984; Ferre y col., 1994). También se ha descrito como procedimiento diagnóstico inespecífico la medición de la respuesta inmune celular expresada por una eosinofilia periférica (Hillyer, 1993). Al respecto se ha descrito que la proteína básica mayor, derivada de eosinófilos, tiene in vitro un elevado efecto destructor de fasciolas (Meeusen y col., 1995).

Investigaciones recientes en busca de alternativas diagnósticas más eficientes y de aplicación a gran escala han demostrado que con las técnicas inmunológicas se puede realizar un diagnóstico temprano de la parasitosis.

Esto tiene el beneficio de permitir adelantar las medidas de control a fechas oportunas para evitar que los parásitos puedan contaminar los hábitats de los caracoles huéspedes intermediarios con sus huevos.

La prueba de ELISA es la que ha probado ser la más eficiente en el diagnóstico de las infecciones por F. hepatica. Sin embargo, si se lograra purificar de los extractos antigénicos aquellas fracciones de mayor sensibilidad y especificidad contra las formas maduras e inmaduras del parásito, esta eficiencia aumentaría aún más (Gorman y col., 1991).

Un método que se ha usado bastante en investigación y para confirmar el resultado de una prueba de ELISA es la electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) y su posterior Western Blot (WB) (Tsang y col., 1983; Margni y Malchiodi, 1989). Mediante SDS-PAGE y posterior WB se han identificado polipéptidos de bajo peso molecular que son sensibles y específicos para F. hepatica.

En el presente trabajo se pretende continuar con la caracterización antigénica de este parásito, semipurificando aquellos polipéptidos que han demostrado ser inmunológicamente relevantes (Gorman y col., 1991), para luego mediante ELISA evaluar el comportamiento de ellos en animales infectados.