Cáncer de colon rectal hereditario no poliposo (HNPCC) Síndrome de Lynch (página 2)

Materiales y métodos.

En el desarrollo del trabajo practico realizamos un análisis genético, donde evaluamos la heterogenicidad del alelo del gen hMLH1, para esto realizamos una PCR para amplificar el exon 16 y verificar la presencia de la delecion de las 3 bases que producen la perdida de una lisina en la proteína.

Reacción de PCR:

  Se realizaron cuatro reacciones de PCR, un control positivo para la delecion del gen (en solo uno de los dos alelos, es decir en heterocigosis), un control negativo para la delecion, un control negativo para la PCR sin añadir DNA (con agua) para comprobar la ausencia de contaminantes en los reactivos de PCR, y por ultimo se realizo una reacción con la muestra incognita.

Para la amplificación por PCR los primers utilizados fueron: hMLH1e16 sense: CATTTGGATGCTCCGTTAAAGChMLH1e16 antisense: CACCCGGCTGGAAATTTTATTTGLa PCR se realizo con un volumen final de 25ul con:

H2O a 25ul de volumen final

Los ciclos realizados fueron: Desnaturalización inicial: 12min a 95ºC Melting 30seg a 95ºC Annealing 30seg a 55ºC Elongación 60seg a 72ºC Elongación final por 10 min a 72ºC

Las muestras obtenidas luego de la reacción de PCR fueron resueltas en un gel de poliacrilamida al 5%. Las muestras fueron corridas a 98volt en buffer TBE 1X con el marcador de peso pUC19.

Protocolo de preparación del gel de poliacrilamida: Acrilamida/Bisacrilamida 5% TBE5X  1X APS 10% 0.04% TEMED 100%      0.1% Agua destilada para llegar a 10ml

Los grupos 1, 2 y 3 realizaron la reacción de PCR con cuatro tubos de reacción un control positivo un control negativo un control de PCR (agua) y una muestra incógnita. Los grupos 4, 5, 6 y 7 realizaron tres reacciones de PCR con loo siguientes controles, control positivo, control negativo y control H2O. Estos fueron sembrados en tres geles de poliacrilamida y fueron corridos por 1hs 30 min. Luego fueron teñidos para su posterior visualización con bromuro de etidio, y fueron fotografiados en el transiluminados con luz UV.

Resultados:

En el gel 1 se sembraron las muestras desde la calle 1, sembró el grupo 1 las muestras del control positivo, control negativo, control H2O y muestra incógnita (respectivamente). Luego el grupo 2 siguió en el mismo orden. Podemos observaren el gel 1 la calle correspondiente a el control positivo para la mutación en condiciones heterozigotas (calle 1) presenta una doble banda bastante difusa. El control negativo (calle2) presenta una doble banda con lo que podemos suponer que se produjo una contaminación o se mezclaron las muestras de DNA, ademas observando el control agua (calle 3) donde no se deberia ver ninguna banda encontramos una banda clara y bien definida.

En la calle 4 la cual contiene la muestra incógnita se ve una banda muy tenue. Suponiendo que el resultado de la muestra incógnita es el correcto y no ocurrio como con las calles 2 y 3, la persona es homocigoto el locus que se esta estudiando, no pudiendose discriminar entre homocigoto wild-type y homocigoto mutante. Para la siembra realizada por el grupo 2 en el control positivo (calle 5) encontramos una unica banda, donde debería haber dos, en el control negativo y en el control agua (calles 6 y 7) no encontramos aparición de bandas por lo que se descarta la posibilidad de una contaminación con DNA. En la calle correspondiente al control negativo debería haber una banda. En la calle conteniendo la muestra (calle 8) no hay ninguna banda por lo cual se asume que no había DNA íntegro en la muestra utilizada, o que se cometió algún error en la PCR.

Figura 1 – Corrida en gel de poliacrilamira. Gel 1

En el gel 2 se sembraron las muestras del grupo 3 el orden control positivo, control negativo, control H2O y muestra, el grupo 4 sembró el control positivo, el control negativo y el control agua, ya que del grupo 4 al 7 solo realizaron estas reacciones de PCR. En este gel se observa que la calles correspondientes al control positivo (calles 1 y 5) presentan en una y dos bandas respectivamente. En el caso de la calle 1 debiera observarse dos bandas, la banda presente es demasiado tenue, por lo cual se puede pensar que si la amplificación hubiese sido mayor, quizas se observase la segunda banda. Las calles correspondientes a los controles negativos (calles 2 y 6) se observan una banda en cada una como es esperable. Mientras que en las dos calles correspondientes a control agua (Calle 3 y 7) se observan bandas muy tenues las cuales pueden deberse a contaminación de los componentes de la PCR o a contaminación durante la siembra de las muestras en el gel.

Figura 2 – Corrida en gel de poliacrilamira. Gel 2

En el gel 3 sembraron el grupo 5, 6 y 7 las muestras en el orden control positivo, control negativo, control agua respectivamente. En las calles 1, 4 y 7 correspondientes a los controles positivos, donde se deberían observar dos bandas, debido a la heterocigozidad, se observan una banda, dos bandas y dos bandas tenues respectivamente. En el primer caso se podría ver la aparición de la segunda banda si se continúa hasta obtener una mayor amplificación. En los controles negativos (calles 2, 5 y 8) se observan dos bandas, en las tres calles, lo cual no es el resultado esperable. Esto puede deberse a que se realizó una mala siembra en el gel de poliacrilamida, o a contaminación con muestra de DNA positiva para la mutación en uno de los dos locus. En las calles correspondientes a control de agua (calles 3, 6, y 9) se observan, nada, dos bandas claras y dos bandas tenues respectivamente. Estos resultados, salvo en la calle 3 no son esperables, en las mismas puede haberse contaminado las muestras con DNA heterocigota.

Figura 3 – Corrida en gel de poliacrilamira. Gel 3

Conclusiones:

En el desarrollo del trabajo práctico no se logró determinar por medio de PCR entre los organismos incógnitas para la mutación cuasal del HNPCC. Los organismos portadores de la mutación en condiciones de heterocigocidad deberían haber presentado dos bandas como producto de la PCR con los primers específicos. La de menor peso molecular de las dos bandas, correspondiente a las dos hebras del genotipo wild-type unidas entre sí o a las dos hebras del genotipo mutante unidas entre sí. No pudiéndose discernir entre ambos pares de hebras unidos, debido a la resolución del gel de poliacrilamida y a que la diferencia entre ambas cadenas es de solamente tres pares de bases. Mientras que la banda que corre como si tuviera un mayor peso molecular correspondería al heteroduplex formado por la hibridización entre una banda mutante y una banda wild-type. Este heteroduplex corre menos ya que se formaba un loop debido a que tres nucleótidos presentes en una de las bandas no estaban presentes en la otra de ellas.

En el desarrollo de este trabajo práctico se obtuvieron muchos resultados no esperados, como bandas simples en muestras de organismos heterocigotas, bandas dobles en muestras de organismos homocigotas, bandas presentes en los controles de agua, etcétera. Estos resultados se pueden deber principalmente a la falta de experiencia en el trabajo de laboratorio y a la falta de organización entre los alumnos de cada grupo y entre los diferentes grupos. A pesar de estos resultados con el desarrollo del trabajo práctico se puedo tomar conocimiento de otra de las aplicaciones de la reacción en cadena de la polimerasa, que en este caso, tiene como finalidad la detección de heterocigotos para la mutación que genera el NHPCC, y así determinar el riesgo que tiene una persona de contraer la patología.

Ayelen Rapoport

Esteban Hernando

Fabián A. Shalóm

Cátedra de Genética Humana – Instituto de Inv. Biotecnológicas – Univ. Nac. de San Martín

Av. General Paz 5445, INTI, Edificio 24 , Prov. de Bs. As.

Octubre de 2007