Caracterización de las glicoproteínas de una cepa de virus respiratorio sincicial aislada en Cali

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RESUMEN: Se empleó un aislado de virus respiratorio sincicial de un niño de dos meses de edad que presentó el primer episodio de infección aguda en un estudio longitudinal efectuado en Cali (1986-1990), para caracterizar molecular y antigénicamente las glicoproteínas virales que son importantes en los mecanismos de inmunopatogénesis en la infección respiratoria aguda generada por este tipo de virus. La caracterización electroforética de proteínas radiomarcadas in vitro con [3H]-Glucosamina permitió evidenciar las bandas de 98, 70, 30 kd como glicoproteínas que hacen parte de la envoltura del virus. La gp 70 es importante en la inmunopatogénesis porque aparece como efecto de protección de tipo IgG transmitida pasivamente por la madre. Se pudieron localizar dos sitios para la proteasa V8 en la gp70 aislada de ambas cepas. La F1 es una de las subunidades comprometidas en la generación de una respuesta inmune de tipo neutralizante determinada en sueros de la fase aguda y en hiperinmunes de conejo. Se demostró la similitud antigénica y estructural de la cepa Cali-0015 con la cepa de referencia Long.

Palabras claves: Virus sincicial. Glicoproteínas virales.

Infecciones respiratorias.

El virus respiratorio sincicial (VRS), miembro del género Neumovirus, familia Paramyxoviridae, es la causa más importante de pneumonías y bronquiolitis de origen viral en niños menores de 2 años. De esta forma produce reinfecciones comunes en presencia de anticuerpos neutralizantes transferidos pasivamente1.

Los mecanismos de patogénesis e inmunidad a la infección por VRS aún no son claros. Es posible que ciertas reacciones inmunopatológicas de tipo IgE específicas puedan potencializar el daño causado por la replicación del virus en el tracto respiratorio de infantes. Esto ha impedido que se pueda desarrollar una vacuna eficaz a pesar de la existencia de un solo serotipo viral2,3.

Un estudio longitudinal de infección respiratoria aguda efectuado en Cali desde 1986 hasta 1990, mostró que el VRS es el principal agente viral causante de la infección respiratoria aguda (IRA) en niños menores de un año (63% de los virus aislados)4,5. Estudios posteriores con respecto a la epidemiología del virus han demostrado su importancia como agente etiológico del cuadro clínico6.

Aunque se han realizado numerosos estudios para caracterizar estructural y funcionalmente los polipéptidos del virión, su identificación todavía no es completa. En general se describen en la literatura de 7 a 10 polipéptidos cuyas masas moleculares relativas (Mr) varían entre 10 a 200 kd7-9. Las glicoproteínas G y F participarían en la inmunoprotección durante el proceso de infección y enfermedad.

Los diferentes aislamientos del VRS, en general, se han clasificado en dos grupos si se tienen como criterio de caracterización, su reactividad diferencial contra anticuerpos monoclonales. Los miembros de estos dos grupos difieren en sus propiedades inmunológicas por lo menos en 4 proteínas estructurales, sobre todo en las glicoproteínas de la envoltura10.

En este trabajo se analizaron, mediante electroforesis, las glicoproteínas de la envoltura de los viriones del VRS y se valoró su inmunorreactividad en la técnica inmunoblot con sueros tanto monoclonales como policlonales obtenidos de conejos y de pacientes en distintos períodos del proceso de infección. Además se realizaron experimentos de fragmentación peptídica en la proteína de 70 kd de la cepa prototipo Long y de una cepa geográfica aislada de un niño con infección respiratoria en Cali.

MATERIALES Y METODOS

Cepas del virus. La cepa de VRS prototipo Long (subtipo A) ATCC-VR-26 se obtuvo en la American Type Culture Collection (Rockville, MD); el aislamiento geográfico, IRA 0015, se consiguió de un aspirado nasofaríngeo del primer episodio de IRA en un niño de dos meses de nacido perteneciente a la cohorte de un estudio longitudinal sobre IRA efectuado en Cali (1986-1990)4. Ambas cepas se reactivaron mediante 15 pases sucesivos en células Hep-2, tituladas y almacenadas a -70 º C para su posterior utilización.

Sueros. Se emplearon los siguientes tipos de sueros: Suero humano correspondiente a la fase aguda del cuadro clínico de IRA donde se aisló el virus 0015; suero humano del período convaleciente al cuadro clínico de IRA causado por el aislamiento 0015; sueros hiperinmunes de conejo anti-RSV aislado 0015 (cepa Cali) y cepa prototipo Long; y anticuerpos monoclonales específicos de subtipo, Mab 92-11c específico para subgrupo E (proteína F) que fueron cedidos gentilmente por el Dr. L. Anderson del CDC en Atlanta, USA.

Cultivo de los virus. Los virus se replicaron por infección de monocapas de células Hep-2 con un inóculo de 100 U TCID50,/1ml, hasta obtener un efecto citopático de 80% en la monocapa (cuarto día de cultivo). Se utilizó medio mínimo esencial sin suero fetal bovino, suplementado con L-Glutamina (400 mM) y una mezcla de antibióticos (penicilina/estreptomicina 100U/100 µg/ml).

Protocolos de purificación del virus. Se aplicaron los protocolos descritos inicialmente por Fernie y Gerin11 y Levine12 con algunas modificaciones. La purificación de cada uno se inició de los virus obtenidos en el crecimiento de 30 frascos de 40 cm2 de monocapas de células Hep-2 que presentaban efectos citopáticos de 80%, las células se removieron mediante el raspado de la monocapa con varillas de vidrio y se resuspendieron en 5 ml de solución amortiguadora (MHN). Después de centrifugación, el sobrenadante se ensayó en pruebas de titulación por TCID5013. La concentración de proteínas en cada ensayo se determinó por el método de Harlow y Lane14.

Los viriones se purificaron después de dos ciclos de ultracentrifugación en gradientes isopícnicos de sacarosa con colchones de 60% a 120,000xg 4 horas a 4º C mediante un rotor TH641 (Sorvall-Dupont). Se aisló la banda opalescente observada en la interfase del colchón que luego se ensayó según lo descrito en el párrafo anterior, con el fin de determinar la presencia y concentración de viriones en cada ensayo.

Las proteínas de las dos cepas de VRS estudiadas se separaron mediante electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida. Algunos experimentos se efectuaron en condiciones reductoras y se adicionó 2-Mercaptoetanol; mientras que en otros casos se usaron condiciones no reductoras, para seguir la técnica de Laemmli15 modificada por Studier16.

Las distintas fracciones de glicoproteínas de las envolturas del virión, se estudiaron por marcación en cultivos celulares infectados en pulsos con [3H]-Glucosamina, después de las fracciones obtenidas mediante electroforesis, se sometieron a fluorografía de acuerdo con Harlow y Lane14. En todos los casos las bandas de proteínas se visualizaron por tinción con nitrato de plata.

Inmunoblot. Las diversas proteínas obtenidas de las preparaciones purificadas en cada una de las cepas estudiadas, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa mediante la metodología descrita por Towbin et al.17; la transferencia se efectuó al aplicar una diferencia de potencial de 50 V durante 18 horas en un aparato transferidor (Bio-Rad). La determinación de las correspondientes bandas inmunorreactivas se hizo con proteína A radiomarcada con 125I.

Fragmentación proteolítica. La banda de 70 kd de cada una de las cepas estudiadas, se purificó por electroelución a partir de geles de poliacrilamida18, que se dializaron de acuerdo con lo descrito por Sambrook et al.19 Las bandas purificadas mediante el procedimiento anterior, se sometieron a digestión proteolítica con la proteasa V8 de Staphylococcus y la tripsina tipo II (Sigma) directamente en el gel de apilamiento. La reacción se efectuó durante una hora; una vez cumplido este tiempo se inició la corrida del correspondiente gel. Las bandas obtenidas por la digestión con cada una de las proteasa, se visualizaron por tinción con nitrato de plata14 o mediante fluorografía.