Práctica de microscopio (página 2)

1. MARCO TEÓRICO:

¿QUÉ ES MICROSCOPIO?

El microscopio es un instrumento óptico que amplifica la imagen de un objeto pequeño. Es el instrumento que más se usa en los laboratorios que estudian los microorganismos. Mediante un sistema de lentes y fuentes de iluminación se puede hacer visible un objeto microscópico. Los microscopios pueden aumentar de 100 a cientos de miles de veces el tamaño original

  PARTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO

• Sistema óptico
• • OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo.
  • OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta.
  • CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.
  • DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
  • FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
• Sistema mecánico
• • SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.
  • PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación.
  • CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular..
  • REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos.
  • TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que consigue el enfoque correcto.

TIPOS DE MICROSCOPIOS:

MICROSCOPIO OPTICO

por lo que la resolución de un objeto es función de la apertura numérica; cuanto mayor Los microscopios de este tipo generalmente producen un aumento de 1000 veces el tamaño original. El límite lo tienen en unas 2000 veces.

Las lentes de un microscopio óptico son el condensador, el objetivo y el ocular. La luz que entra en el sistema debe enfocarse sobre la preparación y para esto se utiliza el condensador. Elevando o bajando el condensador puede alterarse el plano del foco de luz y elegirse una posición que consiga el foco preciso. El objetivo es la lente situada cerca del objeto que se observa. El aumento primario del objeto es producido por la lente objetivo y la imagen se transmite al ocular, donde se realiza el aumento final. Los microscopios que se usan normalmente en microbiología están equipados con tres objetivos: bajo poder, alto poder y objetivo de inmersión. Estos objetivos están montados sobre una pieza que se llama revolver que puede rotarse para alinear el objetivo deseado con el condensador.

La imagen formada por el objetivo es finalmente aumentada por el ocular. El aumento total de un microscopio compuesto es el producto del aumento de su objetivo y de su ocular. El microscopio compuesto es capaz de conseguir aumentos considerablemente mayores que el microscopio construido con una sola lente. Este último, llamado microscopio simple, se usa principalmente como lupas y cristales de aumento.

Además del aumento, una propiedad importante de un microscopio es su poder resolutivo; esto es la capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy cercanos. Cuanto mayor sea el poder resolutivo, mayor será la definición de un objeto. Los microscopios de gran poder resolutivo son especialmente buenos para ver pequeñas estructuras. El poder resolutivo de un microscopio compuesto depende de la longitud de onda utilizada y de una propiedad óptica de la lente conocida como apertura numérica. Como los microscopios ópticos utilizan luz visible, la longitud de onda está fijada y es sea la apertura, el objeto resuelto será más pequeño.

0.5 l

d = ———–

N sen a

d: poder resolutivo; l: longitud de onda; a: mitad del ángulo de la lente objetivo; N: índice de refracción del medio; N sen a: apertura numérica.

Un factor que afecta a la apertura numérica, además de la construcción de la lente, es el medio a través del cual pasa la luz. Mientras que el objetivo esté separado del objeto por el aire, su apertura numérica nunca será mayor de 1,0; para conseguir aperturas numéricas mayores que ésta, el objetivo debe estar inmerso en un líquido de mayor índice de refracción que el aire. A estos líquidos se les denomina aceites de inmersión que se utilizan con los objetivos de inmersión obteniendo una apertura numérica entre 1,2 y 1,4. Aún así, al utilizarse la luz visible (longitud de onda) estos microscopios llegan a tener un poder de resolución de aproximadamente 0,25 µm, lo que significa que las partículas con un tamaño más pequeño de 0,25 µm no pueden distinguirse unas de otras.

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO

Los microscopios electrónicos utilizan rayos de electrones en lugar de la luz, lo que les permite tener un poder de resolución muy elevado. La longitud de onda de los rayos de electrones es de 0,005 – 0,0003 nm, muy corta comparada con la de la luz visible (426 – 750 nm; violeta – rojo). Es posible con el microscopio electrónico resolver objetos separados por una distancia de 0,003 µm, comparado con los 0,25 µm de uno óptico. Los aumentos pueden llegar a ser de un millón de veces.

A causa de la naturaleza de este instrumento sólo pueden examinarse objetos muy delgados; incluso una sola bacteria es demasiado gruesa para ser observada directamente. Por lo que, para preparar muestras para el microscopio electrónico se necesitan técnicas especiales de cortes ultra finos. Para seccionar las células primero deben ser fijadas y deshidratadas (etanol o acetona). Después de la deshidratación, la muestra se incluye en una resina y es aquí donde se realizan cortes finos con un ultra micrótomo, por lo general equipado con una cuchilla de diamante. Una sola célula bacteriana puede cortarse en cinco o seis secciones muy finas. Si sólo tiene que observarse el contorno de un organismo, no son necesarias secciones finas por lo que se montan células enteras que se recubren de una capa fina de un metal pesado (oro). El rayo de electrones es dirigido sobre la preparación y los electrones dispersados por el metal pesado activan una pantalla de observación produciendo una imagen. A la primera técnica se la denomina Microscopía Electrónica de Transmisión (MET) y a la segunda Microscopía Electrónica de Barrido (MEB).

MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO

2. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones.
3. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.
4. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.
   2. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.
   3. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítida la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.
5. Para realizar el enfoque:
0. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.
   2. Bajar totalmente la platina.
   3. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite.
   4. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de x40.
   5. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.
   6. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión.
   7. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.
   8. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande.
   9. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3.
   10. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación.
   11. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio.
1. Empleo del objetivo de inmersión:

MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES

2. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda.
3. Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo.
4. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica.
5. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio.
6. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción.
7. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina, revólver y condensador).
8. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del ocular.
9. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido, secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño humedecido en xilol.
10. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión práctica y, al acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión general de los mismos.

1. Los procedimientos realizados con la manipulación del microscopio óptico compuesto viendo sus partes, su morfología, sus uso e importancia.

2. PROCEDIMIENTOS:

   La ciencia que investiga los objetos pequeños utilizando este instrumento se llama microscopía.

   Sin este aparato seria imposible visualizar los microorganismos a simple vista es fundamental en el avance de la citología, citogenética, microbiología, fitopatología virología, bacteriología, parasitología y demás ciencias que se trabaja con microorganismos.

3. CONCLUSIONES:
4. BIBLIOGRAFÍA:

Hernandez, M. manual de laboratorio, citología e histología. UAAAN México, Editorial Chapingo,1990.

Moellring,F.K., la microscopia desde el principio (folleto tecnico),Carl Zeis Obertkochen/ wurtt, 1971.

Wildor Huanca Apaza

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

PUNO-PERÚ