Aislamiento, caracterización y actividad biológica de polisacáridos microbianos (página 2)

Estos métodos son muy efectivos para eliminar proteínas, ácidos nucleicos, otros polisacáridos (quitina, manano, glucógeno) y lípidos.   Sin embargo se reportan la presencia de ácidos grasos derivados de levaduras en el  b(1,3)  D-glucano, como   ácidos grasos no saturados y saturados de 16 a 18 carbono, que se encuentran en pequeñas proporciones en los b – glucanos aislados de levadura, particularmente de S. cerevisiae  y pueden ser eliminados mediante extracciones sucesivas calientes de etanol.         

Los glucanos se caracterizan por su particular actividad inmunoestimulante y por su notable seguridad por la ausencia de impurezas las cuales son frecuentemente asociadas a este polisacárido.   

Se reportan b- glucanos con actividad biológica de S. cerevisiae  y Candida albicans   con las características de tener un contenido de b  glucano de 95-97 % , de quitina de 3,5 % y no se reportan manano; el contenido de proteínas es menor que 0,3% : La relación entre los enlaces b (1,3) y b (1,6) es igual o cercano de 1.1.

3. Características Físico- Química de los glucanos particulados aislado de S. cerevisiae   

—Análisis elemental.

El glucano aislado de S. cerevisiae revela una composición (mol %) de 40.03% de carbono, 6.72% de hidrógeno, 49.9% de oxígeno y menor del 0.5 % de nitrógeno y azufre.  

— Solubilidad  

Parcialmente soluble en 1M NaOH (0.66%).

Soluble en Dimetilsulfóxido.

Insoluble en agua, metanol, etanol, acetona, cloroformo.

–Reacción de color  

Reacción antrona- ácido sulfúrico: Positivo. 

Reacción  fenol- ácido sulfúrico: Positivo . 

Reacción carbazol: Negativa.

Reacción ninhidrina; Negativa

–Apariencia:

Después de liofilizado se observa un polvo blanco. 

— Componentes en azúcar.       

Es completamente hidrolizado por la acción de ácidos inorgánicos y orgánicos. El resultado es analizado por cromatografía en papel, gaseosa y por el método glucosa– oxidasa y se comprobó que es un monosacárido del tipo D- glucosa  

 Otras características Físico- Química son referidas en la tabla 1 con el empleo de cromatografía de exclusión de alta resolución (HPSEC)  en línea con su fotómero de ángulo múltiple con luz láser ( Malls) y un viscosimetro diferencial.     

TABLA  N° 1. Promedio de los pesos moleculares, y otras características físico-químicas del  b (1, 3) glucano insoluble deSaccharomyces cerevisiae  

4. Análisis conformacional  de los b -glucanos. 

Entre las técnicas  físicas que más ampliamente han contribuido al estudio de las conformaciones de los polisacáridos, cuatro son singularmente importantes. Se trata de la difracción  de los rayos X, la resonancia magnética nuclear,  la espectrometría  de masa y la espectrometría infrarroja  

4.1. Difracción de rayos X

Los sólidos ordenados ocasionan una difracción tridimensional de los rayos X, si la longitud de onda de la radiación es el mismo orden de magnitud que las distancias interatómicas, tal método ha dado excelentes resultados en los que conciernes de las estructuras glucosidicas, tanto para las osas como para los polisacáridos.            

Se pueden obtener estructuras polisacáridos fibrosas en capas orientadas por desecación sobre cristal de soluciones concentradas de estos productos. Estas fibras se presentan entonces localmente como alteraciones de zonas cristalinas y amorfas. Las zonas cristalinas tiene un eje principal paralelo al eje de la fibra, los otros eje de la fibra están orientados perpendicularmente al eje principal.         

Si un has monocromático de rayos X atraviesa tal estructura, sufre difracciones análogas a los que impondría  un cristal único que girase alrededor del eje de la fibra, creando así interferencias. Se obtiene entonces sobre una pantalla diversos impactos de haces que corresponden a difracciones meridionales o ecuatoriales. Las distancias entre los primeros permiten calcular las dimensiones de las unidades glucosidicas elementales, mientras que los segundos dan una idea vasta exacta de las difracciones repetitivas alrededor del eje (hélice, por ejemplo) Los xilanos estudiados por difracciones de rayos X están a favor de una organización de triple hélice. Los glucanos aislados de levadura de S. pombe y S. cerevisiae  fueron estudiados mediante esta técnica determinando una estructura estable de triple hélice. 

4.2    Resonancia magnético- nuclear.

La resonancia magnético nuclear (RMN) juega un papel importante en la elucidación estructural de cualquier compuesto, conjuntamente con la espectroscopia infrarroja (IR). Esta se fundamenta en las propiedades magnéticas de los núcleos atómicos. La frecuencia de resonancia de un conjunto de protones (H+) que forman parte de un sistema molecular depende del entorno electrónico de los mismos. Se estudian los espectros RMN según tres parámetros, desplazamientos químicos, acoplamiento espín-espín y movilidades de estructuras.       

Los más utilizados son los espectros de protón 1H  y del C13 .Un gran número de conformaciones de los polisacáridos se conocen gracias al espectro RMN, como por ejemplo, las clasificaciones de las levaduras en función de la conformación de sus polímeros de manosa. La RMN de C13  ha dado, desde 1969, excelentes resultados para diversos glucósidos en los que algunos de los átomos de carbono había sido objeto de un enriquecimiento isotópico            

El b-glucano aislado de S. cerevisiae, polisacáridos insolubles fue estudiado mediante RMN   y se reportó su caracterización espectral y la determinación estructural. La espectroscopia C13  RMN fue utilizada para determinación de los grados de ramificación en los b- glucanos de esta levadura. Se pudo constatar que no existen ramificaciones y que están conformadas por enlaces tipo b(1,3); en otros casos de b- glucanos de otros orígenes reportados, se detecta generalmente hasta 4% de ramificaciones. En el espectro se observaron seis señales de carbono (tabla 2) que coinciden con los reportes de otros polímeros  de b- glucano.   

TABLA N° 2. Señales químicas del espectro de RNM C13  de glucanos insolubles en Me2  S06  deuterado

 expresados en ppm.

4.3    Espectrometría  infrarroja.

La espectrometría  infrarroja ha encontrado  interesantes aplicaciones en los estudios de conformación de los polisacáridos. Entre los numerosos ejemplos  de esta posibilidad se puede citar determinaciones de las configuraciones anoméricas, las configuraciones axiales o ecuatoriales de los sustituyentes, etc. El espectro también es sensible a las interacciones entre grupos.     

El análisis estructural de los b- glucanos se ha basado, en parte, en sus espectros infrarrojos. Aunque este es característico de la molécula entera, las estructura anoméricas (a y b)  y tipos de enlaces b(1,3) ,(1,6) ,(1,4) dan lugar siempre a bandas en determinados  intervalo de frecuencia, independiente de la naturaleza del resto de la molécula .    

La permanencia  de estas bandas características permite una amplia utilización de la espectrometría  IR en la observación  de información estructural por simple inspección del espectro y el uso de tablas de frecuencias de grupos característicos.     

La absorción máxima de 890 cm. -1   indica la existencia de enlaces glucosidicos, que  significan que los residuos de la glucosa están unidos de forma b(1,3), pueden aparecer  bandas a los 920cm-1 que identifican  a los enlaces b(1,6), bandas a los 850 cm. -1   que representan la presencia de enlaces a anoméricas y bandas a 1645 cm. -1    de b(1,4)  identificados como quitina.  

4.4     Espectrometría de masa.

La espectrometría de masa permite identificar una muestra, inferir la estructura de un compuesto desconocido, estudiar la pureza de una muestra y analizar cualitativa y cuantitativa una mezcla. Este procedimiento  puede ser de ionización química positiva o ionización química negativa y es específico para cada compuesto.    

Se expresa, sobre un diagrama de fragmentación especifico del compuesto, el  número de iones obtenidos en función de su peso molecular. Acoplada  a la cromatografía en fase gaseosa, la espectrometría de masa viene dando resultados desde hace más de  20 años.     

   El b(1,3) glucano , Aureobasillan, aislado de Aureobasidium pullulam mediante esta técnica se caracterizó  y se determinó su peso molecular y la posición de las unidades de D-glucosa y sus radios moleculares. La cromatografía  gaseosa y la espectrometría de masa se emplean para detectar en el  b(1,3)  glucano  insoluble contenido de lípidos, impureza con mayor frecuencia y se han encontrado hasta un 45% de lípidos con relación al glucano.     

5.  Solubilización  de los b -glucano particulados.

Los b(1,3)  glucano con actividad biológica pueden ser solubles e insolubles en agua   El aislado de S. cerevisiae  se caracteriza por ser soluble en agua y en muchos solventes orgánicos por lo que los estudios se han dirigido a su solubilización del mismo para sur empleo en medicina humana. Preparaciones solubles no fosforiladas obtenidas mediante hidrólisis  con ácido fórmico demostraron  que se obtienen un  bajo rendimiento además de la diversidad de las fracciones alcanzadas por este método hacen que estas preparaciones no sean aplicadas  con fines profilácticos y terapéuticos     

Otro método  empleado  para  la solubilización  de glucano particulado fue realizado  con dimetilsulfóxido (DMSO), relajante molecular que actúa sobre las configuraciones tipo hélice de las moléculas. Estas preparaciones resultaron tóxicas al ser inoculadas en animales de laboratorio.    

 Posteriormente, se realizó una precipitación del glucano en la soluciones de DMSO,  añadiendo etanol al 100%, la precipitación se colectó y liofilizó. Cuando este glucano liofilizado fue añadido al agua, el glucano particulado se reformó.    

Sin embargo, todo intento de convertir las preparaciones de glucano neutral en preparaciones polares mediante la adicción de grupos fosfatos y sulfatos, así como la acetilación han resultados infructuosos.  

  Se han estudiado modificaciones en el método de solubilización con DMSO en presencia de urea para la ruptura estructural, seguido de una fosforilización de cada una de sus simples cadenas, obteniendo un   b -glucano  soluble en agua no tóxico, no inmunógeno, apirogénico y capaz de realizar profundos cambios en la respuesta inmunológica cuando es administrado  in vivo en animales y en  humanos.  

6. Actividad inmunológica del b(1,3)  glucano.

El glucano es descrito por varios autores como potente inductor de los mecanismos no específicos de defensa del hospedero, modulador de la inmunidad celular, humoral y del sistema reticuloendotelial

Diversos b(1,3) D- glucano estimulan varias facetas de la respuesta inmunológica en animales y en humanos. Se describen la actividad antitumoral de preparaciones insolubles de b(1,3)  glucano en modelos de animales de laboratorio y demuestran que la administración intravenosa en ratas modifica el curso de enfermedades neoplásticas experimentalmente inducidas, evidenciando por un aumento y proliferación de monocitos y macrófagos.  Al estudiar la actividad biológica de glucanos solubles sobre células tumorales, en las que se observa un incremento en la actividad citotóxica. Debido a sus características inmunomoduladoras, el b(1,3)  glucano se incluye dentro de los medicamentos modificadores de la respuesta biológica MBR).            

 Su uso en humanos a partir de resultados preclínicos y clínicos, indicaron efectos positivos en la aceleración de cicatrización de las heridas y úlceras, además decrecieron las incidencias y secuelas sépticas en pacientes operados y con traumas tratados con esas poliglucosas.  

Su actividad como inmunoestimulante en animales es reconocida en carneros y se observó la estimulación de mácrofagos, polimorfonucleares neutrófilos y linfocitos T.   Al evaluar su efecto en comparación con levamisol en terneros se observó una reducción de la incidencia de los procesos respiratorios y diarreicos de los animales tratados con los  dos inmunoestimulantes, así como la reducción del tiempo del cuadro clínico, mejorando los indicadores de crecimiento, no se señalaron diferencias significativas en las dos variantes evaluadas.  Se evaluó en terneros la influencia de este biopreparado  sobre la actividad reductora del nitro blue tetrazolium (NBT), elemento que justifica el incremento de la resistencia a enfermedades infecciosas de los terneros tratados con el b(1,3)  glucano. Se evidencio, además, cómo esta poliglucosa aplicada por  la vía intraperitonial puede estimular la actividad de los PNM neutrófilos. 

La administración de las preparaciones solubles e insolubles de b(1,3)  glucano en animales irradiados demostró un aumento de la actividad hematopoyética, como fue la granulopoyesis, monocitopoyesis y eritropoyesis .El efecto hematopoyético del b(1,3)  glucano se correlaciona con el incremento de los conteos de leucocitos en sangre periférica, médula ósea, celularidad del bazo, que refleja un aumento numérico granulocitos y macrófagos.     

Un gran número de estudios revelaron que el b(1,3)  glucano, particulado o insoluble, modifica significativamente el curso de una gran variedad de enfermedades infecciosas desarrolladas por bacterias, virus, hongos y parásitos.

  Se ha  podido  obtener un aumento de la sobrevivencia en modelos de animales infectados con Escherichia.coli (que produce peritonitis y sepsis), Candida albicans, Staphylococus aureus etc. Estos resultados están relacionados con un aumento en la actividad de fagocitosis por los macrófagos, así como por el incremento en la actividad del suero lizosomal en animales tratados.

Se describe que el b(1,3)  glucano  es un potente adyuvante de vacunas vírales, bacterianas, parasitarias  El  desarrollo de una vacuna contra Trypanosoma cruzi utilizándolo como adyuvante en ratones dio lugar a una protección contra  esta infección. La inmunización de glucano más T. Cruzi  incremento significativamente la sobrevivencia y decreció los niveles de parasitemia en sangre periférica de ratones, los cuales fueron comparados con controles apropiados.       

Se  han encontraron resultados similares en vacunas parasitarias tales como Babesia microti y Schistosama mansani, en vacuna viral de Newcastle y vacunas contra la furunculosis en Salmón Atlántico.  El mecanismo de acción esta relacionado con la actividad de estimular la respuesta inespecífica, donde los macrófagos y otras células inmunes están involucrados.   

Los b  glucanos  tienen una potente actividad antitumoral. Por ejemplo, se reporta que el b(1,3)  glucano  particulado inhibe el crecimiento de tumores y prolonga la sobrevivencia  en ratones lo que fue estudiado en cuatro modelos de tumores murinos como adecarcinoma BW 10232, carcinoma anaplasmático 15091A, melanoma B16 y leucemia espontánea linfocitica BW 5147.  

Se ha estudiado la base celular de la actividad antitumoral del b- glucano, la actividad antitumoral citotóxica de macrófagos peritoneales de ratones controles e inoculados con este glucano. Los resultados arrojaron que los macrófagos peritoneales de ratones tratados produjeron una respuesta citotóxica significativamente mayor en comparación con los macrófagos normales

Además experimentos in vitro  utilizando tumores y células normales incubadas con b- glucano insoluble demostraron que ejerce un efecto citotóxico directo  sobre las células de Sarcoma y Melanoma y un efecto proliferativo  sobre células del bazo y médula ósea.  Estos estudios indicaron que el glucano, cuando es administrado terapéuticamente podría inhibir significativamente las metástasis hepáticas, el crecimiento de tumores primarios, aumentar la sobrevivencia, posiblemente por un incremento de las células K, así como el efecto citostático directo de este sobre las células del sarcoma.         

Los mecanismos celulares y moleculares de estas modificaciones de la respuesta inmune no están completamente esclarecidos. Existen numerosos reportes acerca de los efectos de la activación del b (1,3) glucano basados en inmunomodulación de monocitos- macrófagos, neutrófilos. Se ha reportado la unión de receptores específicos en  monocitos- macrófagos, neutrófilos, células NK y células microgliales   También se notifica que activan la señal de patrones de   y modula la liberación de ciertas citoquinas  

7.  Correlación de la actividad biológica del bD glucopiranosa de origen microbiano con su estructura.

Por más de  30 años se han realizado estudios de varios tipos de polisacáridos de diferentes fuentes microbiológicas como inmunomoduladores y se  elucidó la relación existente entre las estructuras de estos y la actividad biológicas. Según algunos estudios realizados con  los polisacáridos microbianos, los b (1,3) glucano de levadura especialmente los que tienen cadenas con enlaces b-D glucosil, tienen fuerte acción como antitumoral debido a la estimulación del sistema inmune  

Las conformaciones de estos polisacáridos confirman que sus actividades antitumorales están estrechamente relacionadas con la estructura de triple  hélice del   b (1,3) glucano. En varios estudios se demostró la diversidad estructural de b-D glucanos de origen fúngico  respecto a la distribución de las ramificaciones y sus diferentes actividades antitumorales.  La conversión de los grupos glucosil residuo  de un átomo 0-6 del enlace (1,3) D-glucosa por el correspondiente grupo polihidroxil desarrolló un aumento de sus actividades biológicas y a su vez la sustitución de los grupos polihidroxil mediante un tratamiento medio con ácido redujo su actividad antitumoral.     

El mecanismo de acción de estos b-D(1,3) glucanos con ramificaciones glucosil no  se ha esclarecido, pero si se conoce que la estimulación de inmunopotenciación relacionada a  la actividad de macrófagos, promueve la diferenciación de las células T y aumenta la actividad NK (Chihara, 1992).    

Se  esclarecieron mediante la resonancia magnética nuclear del  C13 la dependencia conformacional que produce cambios en la actividad biológica de los  b (1,3) glucanos. Se observaron tres conformaciones, simple cadena, simples hélices  y triples hélices las cuales fueron distinguibles entre si por  la alta resolución de los métodos empleados, relacionando las actividades biológicas, que fueron diferentes unas de otras, y se destacó que los b(1,3) glucanos de triple hélices fueron más fuertes sus actividades antitumorales.  

En este sentido,  la actividad de un b-D(1,3) glucano triple y simple hélice (Schizophllan) en ratones confirman que la actividad biológica e inmunofarmacológica depende de la estructura de los glucanos, de su peso molecular, de los grados de ramificación, de la conformación y su uso clínico. La transformación de este glucano triple hélice a simple hélice mediante tratamiento alcalino demostró que algunas actividades como el efecto antitumoral in vivo, la respuesta hematopoyética sobre la ciclofosfamida inductora de leucemia, el efecto antagonista zimozan mediador de la síntesis del peróxido de hidrógeno sobre los macrófagos peritoneales, fueron diferentes entre ambos.        

Figrura 1. Obtención de los polisacáridos de la pared celular de Saccharomyces cerevisiae,.

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Autora:

Ing. Lilian Sanchez

Grupo Desarrollo

Dirección de Producciones Biofarmacéuticas

Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria

Cuba.