Mediante el uso de técnicas inmunológicas se ha detectado material glucoproteico procedente también de la fusión de vesículas del aparato de Golgi (Perotto S. y col., 1991). A finales de la década pasada, se identificó a uno de los componentes glucoproteicos del fluido como miembro de la familia de las lectinas y se le ha llamado PsNLEC-1 (Dahiya P. y col., 1997). Se ha demostrado que la presencia de estas lectinas está relacionada con la maduración de la bacteria hacia bacteroide, ya que en mutantes de guisante incapaces de glucosilar a estas proteínas los bacteroides detienen su desarrollo en una forma inmadura (Dahiya P. y col., 1998).
La diferenciación de los bacteroides fue observada por primera vez por Beijerinck en 1888 (Beijerinck M.W., 1888). Dependiendo del sistema simbiótico, los rizobios al invadir las células del córtex sufren un destino distinto. En nódulos indeterminados las bacterias que se liberan al citoplasma dejan de dividirse poco después de diferenciarse. En el proceso de diferenciación pueden o bien aumentar su tamaño original de cuatro a siete veces, como es el caso de Sinorhizobium meliloti, o bien adquirir un forma de "Y", como el caso de Rhizobium leguminosarum. En nódulos determinados sin embargo, las células infectadas mantienen momentáneamente la actividad mitótica por lo que las bacterias en el interior de la gota endofítica siguen dividiéndose con el fin de poder mantener su presencia en las células vegetales recién formadas. Al igual que en nódulos indeterminados las bacterias incrementan su tamaño aunque no cambian de forma.
Esquema de funcionamiento de un nódulo
ACTIVIDAD DE LA NITROGENASA: SUBUNIDADES, SÍNTESIS, MECANISMOS DE ACCION
NITROGENASAS
Todos los microorganismos que convierten el N2 en amoniaco lo hacen gracias a la actividad del complejo enzimático Nasa; la enzima requiere de la colaboración de otras dos proteínas llamadas ferrodoxina y flavodoxina; éstas actúan como donadores de electrones y reductores naturales de la Nasa.
El complejo enzimático Nasa, que cataliza la reducción del N2 en amoniaco, está constituido por dos metaloproteínas, y contiene tres tipos de grupos prostéticos. La
nomenclatura para designar estas proteínas es variable. Así, la proteína I es llamada también dinitrogenasa o "Fierromolibdeno- proteína". El otro componente, la proteína II, es igualmente nombrada dinitrogenasa reductasa o "Fierro-proteína".
Para su funcionamiento, el complejo requiere un donador de electrones de bajo potencial, de la hidrólisis de ATP y de un ambiente estrictamente anaerobio. La proteína I es un tetrámero de alrededor de 220,000 Da, formado por dos tipos de subunidades α2 β2, de masa molecular semejante, y que son los productos de los genes nifDK . Esta proteína contiene el cofactor con fierro y molibdeno (FeMo-Co). La composición metálica global de la proteína I es de 2Mo, 30 Fe y 30S. Por lo tanto, la proteína contiene además dos grupos prostéticos diferentes: cuatro grupos 4Fe-4S, llamados grupos P ligados de manera covalente a residuos de cisteína de las subunidades α y β y los dos grupos FeMoCo unidos a la subunidad α, donde se propone que son transportados los electrones y es reducido el N2. La proteína II es un dímero de alrededor de 68,000 Da, formado por dos subunidades idénticas unidas por un grupo prostético único de 4Fe-4S. El gene responsable de la síntesis de esta proteína es nifH. Esta proteína tiene la función de transportar los electrones del donador fisiológico de electrones (ferrodoxina o flavodoxina),
hacia la proteína I para llevar a cabo la reducción de la molécula de N2, (Figura 3). La Nasa es sumamente lábil a la inactivación por el 02; de hecho, para su purificación se requieren condiciones anaeróbicas estrictas debido a que el cofactor FeMoCo es irreversiblemente desnaturalizado y oxidado (Figura 4). La FBN es un proceso que requiere un gasto considerable de energía, de ahí que su biosíntesis esté sometida a una estricta regulación. Ha sido determinado que, bajo condiciones de laboratorio, se requieren 16 moléculas de Mg-ATP y se produce además una molécula de H2.
La ecuación global es:
N2 + 8H+ + 8e- + 16 Mg-ATP 2NH3 + H2 + 16Mg-ADP + 16Pi
En condiciones naturales se ha estimado que la demanda energética es mucho mayor de 20-30 moléculas de ATP. Por esta razón, los microorganismos han seleccionado mecanismos para inactivar a la enzima cuando está disponible el nitrógeno combinado; esto le permite mantener las necesidades del microorganismo y evitar un gasto energético inútil.
La hidrólisis de ATP está acoplada a la transferencia de electrones (e-) hacia la proteína I; dos moléculas de ATP son hidrolizadas por cada par de e- transferidos. Se piensa que los grupos P tiene una función en la transferencia de e-. De manera similar, el complejo de la Nasa cataliza igualmente la reducción de análogos estéricos del N, en particular el acetileno, que es reducido a etileno. Esta propiedad es la base de un método relativamente sencillo para analizar la actividad de la Nasa por cromatografía en fase gaseosa. Este método ha permitido también el descubrimiento de otros diazótrofos utilizando el sencillo medio de cultivo sin nitrógeno llamado
nfb (nitrogen fixation biological), descrito en Brasil por Joanna Döbereiner.1 En este medio se adiciona una fuente de carbono y algunas sales, la fuente de N es el molecular, por lo tanto los únicos microorganismos que se desarrollarán serán aquellos que sean capaces de FN. Se inocula al medio una porción de raíz, del nódulo o bien la bacteria ya aislada por picadura y el desarrollo del microorganismo se realizará en la zona en la cual exista una p02 menor a 0.02% (microaerofilia) debido a que, como ya se mencionó, la enzima es sumamente sensible a este gas. Este método ha permitido aislar e identificar diazótrofos de diferentes habitats.
En 1972, Dixon y Postgate (citado en 3), transfirieron los genes nif (por nitrogen fixation) de Klebsiella pneumonie a Escherichia coli creando una nueva especie fijadora de nitrógeno.
Ello condujo a proponer, como una solución al problema de la nutrición vegetal, la transferencia directa de los genes nifHDK a las plantas.
Este objetivo está lejos de ser obtenido, ya que la genética de la FBN ha resultado sumamente compleja y está sometida a un control estricto y refinado, justamente por la importante demanda energética. Se han descrito alrededor de 20 genes involucrados en la FBN, cuya secuencia y funciones han sido ya determinadas. Se ha descrito también que los genes estructurales de la Nasa están sumamente conservados, así como un cierto número de otros genes cuyos productos juegan un papel en la maduración de la enzima, la síntesis del cofactor, el transporte de Molibdeno (Mo) y la regulación.
3 En el microorganismo diazótrofo de vida libre Azotobacter vinelandii, se describieron por vez primera tres Nasas diferentes. Una de ellas es la "convencional" Nasa a Mo. Esta Nasa-1 es expresada en medio que conteniene Mo. Las otras dos, llamadas Nasas "alternativas", incluyen a la Nasa-2; ésta es un complejo enzimático que contiene Vanadio (V) en lugar de Mo. Tal complejo enzimático está formado por dos componentes:
la dinitrogenasa reductasa-2, un dímero de dos subunidades idénticas, y la dinitrogenasa-2, la cual es un hexámero de MMr 240,000 Da con tres tipos diferentes de subunidades (α, β y δ). La dinitrogenasa reductasa-2 tiene una masa molecular relativa de alrededor 62,000 Da, contiene cuatro αtomos de Fe y cuatro grupos -SH ácido lábil por dímero; la dinitrogenasa-2 contiene dos átomos de V, 23 átomos de Fe y 20 grupos -SH ácido lábil por molécula. El cofactor FeVaCo análogo al FeMoCo se ha extraído de la dinitrogenasa. La Nasa-3 contiene Fe en lugar de Mo y V. Constituida también por dos componentes, la dinitrogenasa reductasa es un dímero de 65,000 Da y dos subunidades idénticas; la dinitrogenasa es un tetrámero de dos subunidades (α y β); esta ϊltima Nasa tiene un gasto energético de ATP
mucho mayor.2 Un reciente y excitante hallazgo realizado por investigadores alemanes (Meyers y cols.,9), se refiere a una Nasa aislada de Streptomyces thermoautotrophicus, la cual presenta varias características originales: los requerimientos energéticos (ATP) son considerablemente menores, la reacción está acoplada a la oxidación del monóxido de carbono (CO) por una enzima adicional, la molibdeno CO deshidrogenasa, que transfiere los electrones derivados de la oxidación de CO al O2, produciendo radicales del anión superóxido (O2 -).
Una superóxido reductasa reoxida los aniones O2 – a O2 y transfiere los electrones a la Fe-Mo S dinitrogenasa para la reducción de N2 a amonio; la enzima no es capaz de reducir etino y eteno; además, es relevante destacar que los componentes de la Nasa son expresados constitutivamente; todo lo anterior hace a esta nueva Nasa sumamente atractiva para su estudio molecular. En resumen, una de las más sorprendentes propiedades del complejo enzimático de la Nasa de S. thermoautotrophicus es su dependencia del O2 – y la insensibilidad
de todos los componentes al O2 y H2O2. Los componentes de esta Nasa son estructuralmente diferentes de las otras Nasas, por lo tanto, los genes que codifican para este complejo enzimático no están relacionados con los genes de las "Nasas convencional y alternativas".9 Estequiometría de la Nasa de S. thermoautotrophicus.
N2 + 8H+ + 8e- + 4-12 Mg-ATP 2NH3 + H2 + 4-12Mg-ADP + 4-12Pi
La sequía reduce la fijación de nitrógeno en leguminosas
En condiciones de sequía, se produce una limitación de carbono en los nódulos de las leguminosas que podría ser la causa del descenso de la fijación de nitrógeno en las mismas. Ésta es una de las conclusiones que ha presentado María Dolores Gálvez en su tesis defendida en la Universidad Pública de Navarra. El trabajo doctoral se titula: Metabolismo nodular en Pisum sativum L. en respuesta a estrés hídrico. Interacciones carbono/nitrógeno y posibles moléculas implicadas en la modulación de la respuesta.
Fijación de nitrógeno y sequía
La fijación biológica de nitrógeno es un proceso de gran interés agronómico y ecológico, puesto que el nitrógeno, después del agua y el carbono, es el nutriente que limita en mayor medida el crecimiento vegetal y la producción de los cultivos. Este proceso resulta particularmente sensible a condiciones ambientales adversas, como el estrés hídrico o sequía. Precisamente el objetivo de la tesis doctoral de María Dolores Gálvez ha sido investigar cómo se produce la regulación de la fijación biológica de nitrógeno en condiciones de sequía.
La reducción del nitrógeno atmosférico a amonio, o fijación de nitrógeno, la llevan a cabo únicamente determinados organismos procariotas. Entre ellos, los denominados genéricamente rizobios son capaces de establecer simbiosis con plantas leguminosas dando lugar a la formación de una nueva estructura radical: el nódulo.
Por un lado, la planta se beneficia del microorganismo, que se encarga de tomar el nitrógeno del aire y transformarlo en amonio de forma que se lo facilita a la planta. Este amonio se incorpora a esqueletos de carbono para formar aminoácidos y proteínas. Por su parte, el microorganismo obtiene de la planta los nutrientes necesarios para su crecimiento.
En condiciones de sequía, se detectó un descenso de la actividad sacarosa sintasa nodular. Este descenso se produjo simultáneamente al descenso de la fijación de nitrógeno, pudiéndose establecer una elevada correlación entre ambos procesos en condiciones adversas. Como consecuencia de la inhibición de la actividad sacarosa sintasa, se observó también un descenso de la concentración de azúcares fosfato y ácidos orgánicos, lo que indica un descenso en el flujo de carbono en los nódulos que limitaría, a su vez, el suministro de carbono al bacteroide, viéndose afectada la capacidad del bacteroide para fijar nitrógeno.
Percepción del estrés hídrico
Con el fin de profundizar en el proceso de percepción y transducción del estrés hídrico que lleva a la inhibición de la fijación de nitrógeno, María Dolores Gálvez estudió también el ácido abscísico y las especies de oxígeno activado como posibles moléculas implicadas en la regulación de la fijación de nitrógeno.
Los resultados obtenidos mediante la aplicación exógena de ácido abscísico sugieren la existencia de, al menos, dos mecanismos distintos de regulación de la fijación de nitrógeno dependiendo de cómo se desarrolla el estrés. En situaciones en que el estrés se produce de forma gradual, actuaría una ruta independiente de ácido abscísico que implica la inhibición de la actividad sacarosa sintasa y en situaciones en que el estrés se produce de forma rápida e intensa, actuaría otra ruta dependiente de ácido abscísico que implica un control por leghemoglobina/oxígeno.
Para analizar la posible implicación de las especies de oxígeno activado en la modulación de la fijación de nitrógeno se recurrió a la aplicación exógena de ácido ascórbico, un antioxidante natural, en plantas expuestas a estrés hídrico. El tratamiento con ácido ascórbico exógeno realizado en condiciones de estrés hídrico ejerció un papel beneficioso sobre el contenido de proteína de la planta. Asimismo, se observó una recuperación de la actividad total de los enzimas del metabolismo del carbono y nitrógeno en nódulos.
Además, la aplicación de ácido ascórbico no revirtió el efecto negativo del estrés hídrico en la fijación de nitrógeno, por lo que no es posible relacionar las especies de oxígeno activado con la regulación de la fijación de nitrógeno. En este contexto, el descenso de la fijación de nitrógeno ocurre asociado a una limitación en el flujo de carbono en los nódulos, provocada por la inhibición de la actividad sacarosa sintasa en dichas condiciones.
Por lo tanto, las señales implicadas en la percepción y en la ruta de transducción de señales que conduce al descenso de la fijación biológica de nitrógeno en condiciones de estrés hídrico son complejas y son necesarios futuros estudios para comprender los mecanismos de regulación de la fijación biológica de nitrógeno.
El avance de las investigaciones en los últimos 20 años ha sido muy importante, si se considera la complejidad de los sistemas enzimáticos involucrados, la fisiología del microorganismo en relación con la producción de energía, las características de la interacción microorganismo-planta y las estrategias seleccionadas en el proceso evolutivo para el control de la FBN. La FBN a amonio es realizada únicamente por procariotes y, en microorganismos con Nasas "convencionales", es un proceso muy sensible al oxígeno. Por otra parte, el proceso de FBN es un componente crítico en el ciclo global del nitrógeno de relevante importancia ecológica. Los mejores fijadores son los que establecen una simbiosis con plantas superiores en la cual la energía para la FN y, en general, el sistema de protección al 02 es proporcionado por la planta. Dentro de los diazótrofos se incluyen los asociados, de vida libre, simbióticos y endófitos.
La FBN es el mecanismo principal de aporte de N en los ecosistemas naturales y es muy importante en la agricultura del trópico. En varios suelos tropicales, debido al bajo intercambio de iones y a la mínima retención de agua de la fracción mineral, la fertilidad del suelo está estrechamente relacionada con el contenido de materia orgánica del suelo. Como el N2 es el elemento más fácilmente perdido cuando la mineralización de la materia orgánica del suelo es estimulada por el arado del suelo, es frecuente que este elemento controle la materia orgánica del suelo y, por lo tanto, su fertilidad. La aplicación continua de fertilizantes no puede ser una opción sostenida para el tercer mundo, ya que los precios de los energéticos son muy elevados, son contaminantes de los mantos acuíferos y muchas veces son perdidos por lixiviación.
El nitrógeno de la biósfera está sujeto a un rápido recambio, y debido a que es perdido como N2 a la atmósfera, su mantenimiento requiere de un continuo reemplazo con N reducido a partir del N2 atmosférico. La Nasa de S. Thermoautotrophicus puede ser una enzima que esté distribuida en microorganismos aislados de ambientes extremos, aspecto que no había sido explorado con anterioridad y abre expectativas alentadoras para la manipulación por ingeniería genética de este complejo enzimático debido a su tolerancia hacia el oxígeno, de tal manera que será relativamente más sencilla su caracterización bioquímica, genética y molecular.
Esta revisión reconoce el papel de la FBN como una manera más efectiva, menos cara y no contaminante, para mejorar la fertilidad del suelo comparada con otras vías (como la fertilización química y la orgánica), las cuales presentan altos niveles
de contaminación con metales pesados, sales nitrogenadas y microorganismos patógenos para el hombre. En nuestro estado de conocimiento actual, tomando en consideración la producción obtenida, la simbiosis Rhizobium-leguminosa es superior a los otros sistemas FN; sin embargo, la investigación reciente realizada con los endófitos podría representar la mejor fuente de fertilizantes "ideales", por lo que demandan un gran interés como área de futura investigación.
Siguiendo otro camino, recientemente Bárbara Rienhart y Thomas Hurec del Instituto Max Plack de Alemania, afirman que han descubierto una bacteria, hasta ahora desconocida (Leptocloafusca), que también fija nitrógeno y que coloniza la raíz del arroz. La bacteria pertenece a un nuevo género que se ha llamado Azoarcus.
Según los investigadores, la planta de arroz colonizada por esta bacteria crece entre un 10% a un 20% más que las plantas control no colonizadas. Si ello se confirma, significaría también que el proceso de nodulación no estaría restringido sólo a las leguminosas. Sin duda que ello es una buena noticia.
- González-López, J. Lluch, C. Interacción planta- microorganismo: metabolismo del nitrógeno. Ed. Rueda SL. Madrid. 1992.
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- Sprent, J.I. Nodulation in legumes. Royal Botanic Gardens, Kew, RU. 2002.
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- Leigh, G.J. The world's greatest fix: a history of nitrogen in agriculture. Oxford University Press. 2004 .
Autor:
Blgo. Wilmer Paredes Fernández
Universidad Nacional de San Agustín
Arequipa – Perú – 2008.
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