Técnicas diagnósticas de referencia para el análisis de marcadores de virulencia del virus pseudorrabia, cepa RC/79: ensayos preliminares

• Introducción
• Material y métodos
• Resultados
• Discusión
• Bibliografía

RESUMEN: En nuestro laboratorio hemos estandarizado los métodos de inmunoperoxidasa e inmunofluores-cencia indirecta para la detección del virus de la enfermedad de Aujeszky en cultivos de células Vero, utilizando como modelo la cepa viral RC/79. Hubo una fuerte correlación entre los resultados logrados por ambas técnicas, las que evidenciaron ser altamente específicas para la identificación del virus y permitieron una precisa localización de los antígenos virales en las células infectadas. La aparición de células multinucleadas o sincitios con marcada reacción en la región nuclear a las 16 horas p.i. indicó que la cepa RC/79 es fuertemente virulenta. Esta aseveración fue corroborada por los ensayos de infección experimental en conejos. El carácter virulento de la cepa se evidenció por un intenso prurito en la zona de inoculación, con la aparición de una lesión rezumante serosanguinolenta entre las 6 y 24 horas previas a la muerte. La misma aconteció en tiempo promedio, a las 62 y 120 horas p.i., dependiendo de la dosis viral inyectada. En todos los casos la tasa de mortalidad fue del 100%, aun trabajando con cantidades menores de virus (102 UFP), indicando ausencia de dosis-respuesta.

Los métodos empleados fueron útiles como marcadores de virulencia para la cepa RC/79 y se constituyen en herramientas indispensables para el diagnóstico de la enfermedad de Aujeszky, disponibles en nuestro laboratorio y posibles de contemplar por las autoridades nacionales cuando establezcan un plan sanitario para esta patología.

Palabras claves: Virus Aujeszky, cepa RC/79, marcadores de virulencia, inmunohistoquímica.

SUMMARY: Referential diagnostic techniques to analyze virulence markers of pseudorabies virus RC/79 strain: preliminary assays"

The indirect immunoperoxidase and immunofluorescence methods were standardized for the detection of Aujeszky's disease virus in Vero cell cultures, using as a model the RC/79 strain virus."

There was a strong correlation in the results obtained by both methods. The results proved to be highly specific for the identification of the virus and allowed a precise localization of the viral antigen in infected cells. The presence of syncytia with a strong reaction in the nuclear region 16 hours p.i. indicated that RC/79 strain is strongly virulent. This conclusion was supported by the results obtained from experimental rabbit infection. The animals were inoculated with different doses of the virus (102-105 PFU). In all the cases the mortality rate was 100%, even when animals received minor doses of the virus, indicating no dose response. The mean death time was 62 and 120 hours p.i. for the different doses used. Between 6 and 24 hours prior to death, all rabbits presented an exudative lesion in the inoculation area and extensive pruritus.

The methods employed were useful as virulence markers of the RC/79 strain virus and on the other hand, they constitute essential tools in the diagnosis of Aujeszky's disease virus.

Key words: Aujeszky's virus, RC/79 strain, virulence markers, immunohistochemistry.

INTRODUCCION

La enfermedad de Aujeszky (EA) o su sinónimo, pseudorrabia, es una enfermedad infecciosa de etiología viral que con muy pocas excepciones es aguda, caracterizándose por producir alteraciones en el SNC y trastornos reproductivos y respiratorios. En la naturaleza la infección ocurre más a menudo en el cerdo, su huésped natural, así como en ganado vacuno, ovejas, perros y gatos (Baskerville y col., 1973). Todas las especies son huéspedes terminales en la cadena epidemiológica ya que siempre mueren, a excepción del cerdo, donde la tasa de mortalidad varía dependiendo de la edad (Akkermans, 1963). El cerdo es el eje fundamental en la epizootiología de la EA, ya que si se recupera de esta afección, permanece latentemente infectado y es el principal reservorio y diseminador del virus (Beran y col., 1980).

Desde el primer diagnóstico de pseudorrabia en Argentina en 1978 (Ambrogi y col. 1981), se ha mostrado una incrementada incidencia de la enfermedad en las principales cuencas de producción porcina nacional (Echeverría y col., 1989, Pereyra y col., 1989; Zanon y col., 1991).

Ante esta realidad y no habiéndose establecido aún, a nivel oficial, un plan de lucha apropiado contra la enfermedad, se hace necesario realizar investigaciones epidemiológicas. Las mismas son parte integral de los programas de control que pudieran implementarse y que requieren de medios efectivos para la identificación de cepas de virus de la pseudorrabia que pudieran aislarse. Por otra parte, cualquier laboratorio que forme parte de la estructura de un programa de control de la enfermedad necesitar· contar con herramientas diagnósticas estandarizadas.

En este estudio hemos intentado poner a punto los métodos diagnósticos referenciales (técnicas inmunohistoquímicas indirectas: inmunoperoxidasa e inmunofluorescencia y la inoculación de conejos) para la identificación del virus de la EA y hemos evaluado la utilidad de las mismas como marcadores de virulencia para la cepa RC/79 del virus de la pseudorrabia.

MATERIAL Y METODOS

Virus. La cepa viral RC/79 de la EA aislada por primera vez en la Argentina (Ambrogi y col., 1981) fue utilizada para la inoculación en conejos y sirvió como antígeno para las técnicas inmunohistoquímicas. El título del stock viral fue de 109 UFP/ml determinado sobre monocapas de células Vero por el método de placas de lisis (Dulbecco,1962).

Animales de experimentación. Se utilizaron 8 conejos hembras New Zealand blancos (Oryctolagus cuniculus) de 1.4 a 2.3 kg de peso y 1.5 a 2.5 meses de vida, provistos por el Bioterio Central de la Universidad Nacional de Río Cuarto.

Ensayos de patogenicidad. Para determinar la virulencia de la cepa RC/79 en conejos los mismos fueron inoculados con 1 ml de la suspensión viral en medio de mantenimiento (medio esencial mínimo de Eagle, suplementado con 2% de suero fetal bovino, 30 µg/ml de gentamicina y 1% de glutamina, pH 7.2-7.4) (MEM). La inoculación se realizó por vía subcutánea en el flanco dorsal inferior.

Para analizar la influencia de la dosis viral sobre la respuesta clínica, tres de los animales recibieron 102 UFP/ml, los cinco restantes fueron inoculados con 105 UFP. La observación de los síntomas se extendió todo el tiempo que el ensayo lo permitió, no superando las 120 postinoculación (p.i.) en promedio.

Todos los animales fueron mantenidos en las salas del bioterio a temperatura ambiente en jaulas individuales.

Cultivos celulares. Para las técnicas inmunohistoquímicas fue utilizada la línea celular Vero, pasaje 35, procedente del ABAC (Asociación Banco Argentino de Células, ciudad de Pergamino). Las monocapas celulares fueron desarrolladas con MEM suplementado con 8% de suero fetal bovino, en policubetas de 24 orificios sobre laminillas de vidrio y recibieron una dosis viral de 103 UFP/ml.

Antisueros. El suero específico antivirus Aujeszky cepa RC/79 fue obtenido de cerdos naturalmente infectados, provenientes de un establecimiento porcino con antecedentes de infección por dicha cepa y con alto título de anticuerpos neutralizantes, determinado por microseroneutralización (Hill y col., 1977).