Azotobacter vinelandii en suelos tratados con estiércol de bovino y el herbicida 2, 4-D

1. Resumen
2. Introducción y antecedentes
3. Material y métodos
4. Resultados y discusión
5. Literatura citada

RESUMEN

La bacteria Gram negativa aerobia Azotobacter vinelandii es considerada fundamental en el ciclo de N por su propiedad de fijar N2 (FBN), sin embargo por su capacidad de utilizar ácidos húmicos del suelo hoy se le asocia al ciclo del C cuando no se observa actividad de reducción de acetileno (FBN) en un suelo enriquecido con ácido p-hidrobenzenico (APB) uno de los principales ácidos húmicos (AU) del suelo con un herbicida y nitrógeno orgánico.

Por lo anterior el propósito de este trabajo fue analizar el efecto del enriquecimiento de dos tipos de suelos estériles sobre el crecimiento y producción de CO2 por el aislado OLD-R de Azotobacter vinelandii. Para lo cual los suelos se ajustaron a un 60% de humedad y enriquecieron con estiércol de bovino al 1% (p/p), y 1.0 ppm del herbicida 2,4-D.

Los resultados indican que en un suelo el 2,4-D, primero inhibió y luego estimuló el crecimiento y la producción CO2 por A. vinelandii. Estos resultado sugieren que el estiércol de bovino estimuló la actividad de la bacteria para mineralizar algunos de los AU contenidos en la materia orgánica de los suelos analizados, con lo que se apoyo el argumento de que A. vinelandii también participa en el ciclo del C y que en el nitrógeno su posición es de menor importancia.

Palabras clave. ácidos húmicos, ciclo del carbono. Mineralización.

INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES

La bacteria Gram negativa aerobia heterotrófica Azotobacter vinelandii se distribuye en suelo, el agua y la rizósfera de plantas (Garcia et al 2005; Sánchez-Yáñez, 1992; Tchan, 1984), fija N2 en ausencia de formas combinadas de ese elemento (Moreno, 1986). A pesar de que se considera autóctona del suelo, mínimos reportes existen sobre su comportamiento, en ese ambiente (Wu et al., 1987). Algunos de estos trabajos (Moreno, 1986; Wu et al.,1987), señalan que crece en el suelo debido a su capacidad para oxidar ácidos húmicos (AU) derivados de la mineralización de la materia orgánica en ese ambiente, lo que sugiere una posible estrategia de la bacteria para supervivir y eventualmente crecer en suelos pobres en materia orgánica, que a la vez la asocia con el ciclo de carbono, ya que está probado que en la naturaleza especialmente el suelo los niveles de N combinado no se reducen lo suficiente para inducir la síntesis de la nitrogenasa, enzima que solo se sintetiza por las bacterias diazotroficas en respuesta a la ausencia de compuestos de N inorgánicos u orgánicos.

En consecuencia es difícil demostrar que naturalmente A. vinelandii y bacterias similares fijen N2. A este respecto se demostró que en un suelo dializado, en ausencia de fuentes sencillas de carbono, pero que contiene AU del tipo p-hidroxibenzoico o m-hidroxibenzoico (Hardisson et al., 1969) la FBN no se detectó (Moreno, 1986). Estos reportes apoyan el argumento de su participación en procesos de la transformación de compuestos del ciclo del C y sugiere que en este ciclo donde probablemente la bacteria realiza su verdadera actividad en el suelo, y no necesariamente en el ciclo de N.

No obstante su capacidad de fijar N2 es una indicación de su potencial en un ambiente artificial como los medios de cultivo sintéticos sin N (Wu et al., 1987) pero no en la naturaleza (Vela, 1998; comunicación personal), lo anterior también se apoya en las observaciones de González–López et al., (1984), Moreno (1986), Wu et al., (1987) y Vela (datos sin publicar, 1998).

Lo anterior se apoya en que la adición de nitrógeno orgánico al suelo estimula la utilización de los AU con estructura química similar a los pesticidas Belajee y Mahadevan, (1989, 1990) y Groseclose y Ribbons (1981). Por tanto los propósitos de este trabajo fueron analizar : el crecimiento y producción de CO2 por Azotobacter vinelandii en suelo agrícola enriquecido con estiércol de bovino y tratado con el herbicida 2,4 D.

MATERIAL Y METODOS

I) Origen de Azotobacter vinelandii.

El aislado Old-R de A. vinelandii fue donado por el Dr. R. G. Vela, del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad del Norte de Texas, E.U.A. El liofilizado de la bacteria se activó en caldo Winogradsky (g/L: KH2 PO4 0.25, MgSO4.7H2O 0.125, Na Cl 0.125, Na2 MaO4.5H2O 0.005, MnSO4.4H2O 0.005, CaCO3 0.1, glucosa 10.0, pH 7.0). El cultivo se agitó a 250 rpm, a temperatura de 28°C por 48 h. Después las células se lavaron por centrifugación en amortiguador de fosfatos 2M, pH 7.2 a 10,000 rpm por 40 minutos y luego se resuspendieron en el amortiguador y se ajustaron a una concentración final de 1X103 células/mL, para inocular los suelos.

II) Preparación de los suelos.

Suelos de los municipios de Marín y General Terán, N. L., México fueron secados y tamizados en una criba de 2 mm de diámetro, se esterilizaron a 15 lb/1 h durante tres días consecutivos y después se sometieron a los siguientes análisis fisicoquímicos: textura, porcentaje de humedad, capacidad de retención de agua, contenido de materia orgánica, pH y porcentaje de nitrógeno, según Palmer & Troeh (1976) y Brady (1974).

III) Crecimiento de A. vinelandii en suelo estéril.

Para realizar el experimento se usaron viales de 25 mL con 10g de cada suelo, inoculados con 1 mL de la suspensión de 1X103 células/mL del aislado Old-R, se incubaron á 28° C una semana. A intervalos de 24 h, un gramo del suelo inoculado se suspendió y diluyó en un amortiguador de fosfato para estimar el número de A. vinelandii bacterias/g de suelo seco en agar Winogradsky, incubadas á 30°C por 48 h.

a) Producción de CO2 por A. vinelandii en los suelos.

Para determinar el efecto del enriquecimiento del herbicida en el suelo sobre la producción de CO2 por A. vinelandii, se uso el método de Stotzky y Norman (l961) para capturar del CO2 en el álcali y titular con HCl. Se colocaron 100 g de cada suelo en matraces tipo Bartha (Bartha y Pramer, 1965), los suelos se enriquecieron con 1% (p/p) estiércol de bovino (esterilizado por separado a 15 lb/30 min) y 1.0 ppm (v/v) del herbicida 2, 4-D (CIBA-GEIGY). Los suelos se inocularon con la misma concentración celular de A. vinelandii usada en el experimento II. Los viales se incubaron durante una semana á 30°C. La producción de CO2 se determinó cada 24 h.

IV) Análisis estadístico.

Se empleó un análisis de varianza con cuatro tratamientos y siete repeticiones, para evaluar el comportamiento de los aislados OLD-R en los suelos estériles. Se incluyó un análisis de correlación para determinar el efecto del tipo de suelo sobre el comportamiento de la bacteria (Torrie, 1995).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

I) Características fisicoquímicas de los suelos.

Los dos suelos mostraron una textura de tipo arenoso, el suelo de Marín, N.L., fue rico en nitrógeno (0.279%), extremadamente rico en materia orgánica (5.14%) con una humedad de 73.3%, El suelo de General Terán N.L., fue mediano en el contenido de nitrógeno (0.185%), rico en materia orgánica (3.70%), con una humedad de 53.3%, (Brady; 1974., Palmer y Troeh, 1976).

II) Crecimiento del aislado OLD-R en los suelos enriquecidos.

En el cuadro 1 muestra que no hubo diferencia en el crecimiento y producción de A. vinelandii en el suelo húmedo o seco de Marín N.L. Tampoco con la adición del estiércol de bovino, posiblemente el contenido de N en el suelo nitrógeno.

El herbicida 2,4-D redujo el número células de la bacteria aunque en poco tiempo después recuperó su número original, lo que apoya que A. vinelandii tiene capacidad genética (Maia et al., 1988) para tolerar la acción del herbicida, como lo han señalado Groseclose y Ribbons (1981), Balajee y Mahadevan (1989,1990), puesto que está demostrado que tiene la capacidad de utilizar AH como fuente de C y energía como una estrategia de sobrevivencia en el ambiente (Maia et al., 1988; Sánchez-Yáñez, 1992).

En el cuadro 2 muestra que el crecimiento de A. vinelandii Old-R en el suelo de General Terán, N.L., no fue diferente al observado en el suelo seco y/o en el húmedo. A pesar de la adición del 1% (p/v) del estiércol de bovino, probablemente por la falta de disponibilidad de este nitrógeno orgánico agregado, en relación con el N presente en el suelo. Se observó un efecto estimulatorio del 2,4-D, sobre el aislado OLD-R en el suelo de Marín, lo que confirma que este herbicida no es específico contra malezas como ha sido reportado por Brow (1973), Beteson et al. (1986). En consecuencia A. vinelandii disminuyó su velocidad de crecimiento.

En el cuadro 3 se muestra que la producción de CO2 en el suelo de Marín por A. vinelandii fue menor que al agregar el estiércol de bovino, en comparación con la cantidad de CO2 producida en el suelo sin adicionarlo, lo cual indica que al saturar el suelo de nitrógeno, se inhibió su actividad metabólica, como se ha reportado en otros microorganismos del suelo (Beteson et al., 1986). La concentración de 1.0 ppm del 2,4 D, disminuyó la producción inicial de CO2, por A. vinelandii, lo que sugiere una relativa toxicidad del herbicida y posteriormente su probable utilización como fuente de carbono y energía, como lo han descrito Belajee y Mahadevan (1989,1990) en otros pesticidas de uso común en agricultura por especies de Azotobacter.

En lo que respecta al la producción de C02 se observo que el estiércol de bovino aplicado en el suelo de General Terán estimuló la cantidad de CO2 producido por A. vinelandii, posiblemente porque las características fisicoquímicas del suelo de probreza de carbona asimilable y nitrógeno, facilitaron la disponibilidad de los compuestos de nitrógeno orgánico agregados. El incremento en la producción de CO2 por la OLD-R al adicionar el 2,4-D, indica que Azotobacter contiene en su genoma vías de asimilación de compuestos naturales similares al herbicida como reportan (Belajee y Mahadevan, (1989) y Robson et al., (1984) lo cual les confiere una ventaja ecológica de mejor capacidad competitiva en el suelo y que apoya su relación con el ciclo del carbono.

CUADRO 1. CRECIMIENTO DE Azotobacter vinelandii OLD-R

EN SUELO ESTERIL DEL MUNICIPIO DE MARIN, NUEVO LEON, MEXICO.

NC= Crecimiento incontable. Experimento realizado por triplicado en agar Winogradsky. Inóculo inicial 1×104 células/mL (Log. No.cel/mL=4.0).

CUADRO2. CRECIMIENTO DE Azotobacter vinelandii OLD-R EN SUELO ESTERIL DEL MUNICIPIO DE GENERAL TERAN, N.L. MEXICO.

NC=Crecimiento incontable. Experimento realizado por triplicado en agar Winogradasky. Inóculo inicial 1×104 célula/mL (Log.No.cel/mL=4.00).

CUADRO 3. PRODUCCION DE CO2 POR Azotobacter vinelandii OLD-R

EN SUELO ESTERIL DEL MUNICIPIO MARÍN, N.L., MÉXICO

Los datos son el promedio de 3 repeticiones. Inoculo de 5-7 mL de 1×104 cel/mL.

CUADRO 4. PRODUCCION DE CO2 POR Azotobacter vinelandii OLD-R EN SUELO ESTERIL DEL MUNICIPIO DE GENERAL TERÁN, N.L. MÉXICO

Los datos son el promedio de 2 repeticiones. Inóculo de 5-7 mL de 1×104 cel/mL.

III) Análisis estadístico.

En el Cuadro 5 se muestra, el análisis de varianza el cual no detectó diferencia significativa (P>0.05) entre tratamientos, en términos de crecimiento y producción de CO2, lo que indica que A. vinelandii utilizó tanto el nitrógeno y los compuestos carbonados presente en ambos suelos, como lo agregado para enriquecerlo como el estiércol, o el 2,4-D.

Cuadro 5. Análisis de varianza del crecimiento y producción de CO2 por Azotobacter vinelandii en suelos de los municipios de Marín y General Terán, N.L. México.

Sum=suma de cuadrado o suma de medio, N.S. No significativo, **estadísticamente significativo.

Cuadro 6. Análisis de correlación para el crecimiento y producción de CO2 por Azotobacter vinelandii en suelos de los municipios de Marín y General Terán, N.L. México.

Torrie, 1995

El Cuadro 6 muestra la correlación del crecimiento del aislado OLD-R en el suelo de Marín versus el suelo de General Terán, el estadístico arrojado, r = 0.228 fue no significativo, pero diferente para la producción de CO2, con una r = 0.717, lo que sugiere que en base a la naturaleza química de los suelos, a su mayor concentración, variedad de carbono y nitrógeno, en el suelo de Marín, el aislado OLD-R liberó la mayor cantidad de CO2.

Estos resultados apoyan la teoría de una reconsideración del papel del género Azotobacter exclusivamente como miembro del ciclo del N. Investigación en progreso intenta reforzar este argumento.

Dedicatoria

Este trabajo es dedicado con mucho respecto y cariño a la memoria de la Sra. Hilaria Aguilar de Tavitas, por ser un ejemplo de fe, esperanza y amor.

AGRADECIMIENTOS

A la CIC de la UMSNH, por el apoyo a la publicación de este trabajo por medio del proyecto 2.7 (2005-2006). "Análisis de la Microflora Fijadora de N2 asociada a Teocintle" y maiz". al M.C PEDRO MORENO del CINVESTAV, Irapuato, Gto, MEXICO, por el apoyo en el análisis estadístico.

LITERATURA CITADA

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*Ma Isabel Tavitas Aguilar,

Roland G. Vela**

Juan Manuel Sánchez-Yáñez***

*Microbiología Industrial y del suelo. Facultade de Ciencias Biológicas. Universidad Autónoma de Nuevo León, Monterrey, Nuevo Léon, México. **Department of Biological Since, University of North Texas, Denton, Tx USA. ***Microbiología Ambiental

autor correspondiente

Instituto de Investigaciones Químico-Biológicas, Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Edificio B-1, CU; C.P. 58000 Morelia, Michoacán, México.