Antagonismo microbiano a: Pantoea agglomerans y Pseudomonas syringae

1. Resumen
2. Introducción y antecedentes
3. Materiales y métodos
4. Resultados y discusión
5. Literatura citada

Resumen

El congelamiento de las hojas en el campo depende de factores físicos, químicos y biológicos. De los biológicos se considera a las bacterias activadoras de núcleos de hielo (BANH) epifitas de la superficie de la hoja o filoplano. Estas BANH responden al cambio ambiental como la elevada humedad y la baja temperatura para "súper enfriarse" internamente y externamente formar cristales de hielo para evitar que ese fenómeno físico las aniquile.

En consecuencia los tejidos vegetales se congelan y la hoja muere. El control químico y biológico utilizado para reducir la densidad de BANH del filoplano y los cristales de hielo, ha generado resultados inconsistentes. Es necesaria información sobre los microorganismos nativos antagonistas a las BANH en cultivo de alto valor económico.

En esta investigación se aislaron microorganismos epifitos de cítricos, antagonistas a BANH. Se determinó su efecto inhibitorio sobre el crecimiento de los ecotipos de BANH en agar nutritivo. Se evaluó el efecto de estos antagonistas sobre la frecuencia de nucleación de hielo de las BANH en hojas de naranjo dulce, naranjo agrio, mandarino y limón. Los resultados muestran la existencia de microorganismos epifitos de cítricos antagonistas a las BANH.

Su aplicación en hojas de tales plantas redujo el daño por congelamiento entre un 15% a un 100%. Los antagonistas a las BANH se identificaron como géneros de Enterobacteraceae y géneros de bacterias Gram positivas: Escherichia coli, Klebsiella sp. Bacillus sp. Micrococcus luteus. Así como una levadura que no se identificó. Se concluye que estos microorganismos epifitos antagonistas (de cítricos) pueden ser una alternativa para reducir el efecto de BANH en cítricos.

Palabras clave: congelamiento, cítricos, filoplano, epifitas.

Antagonistic microorganisms against ice nucleation active bacteria: Pantoea agglomerans and Pseudomonas syringae.

SUMMARY

Leaf frosting in the field depends upon physical, chemical and biological factors. Among the biological factors are epiphytic ice nucleation active bacteria (INA) found on the plant surface or phylloplane. INA responds to environmental changes like high humidity and low temperatures by supercooling internally and externally forming ice crystals for survival. As a result stomates freeze and the leaves die. Chemical and biological control to reduce INA populations on the phylloplane has shown variable results therefore, research is needed to find antagonistic microorganisms in high value crops. In the present study epiphytic bacteria from citrus trees were used as the source of native antagonistic microorganisms to ice-nucleating bacteria (INA).

Their capability to inhibit growth of INA was evaluated on nutrient agar. The effect of antagonistic microorganisms on the frequency of the ice nucleation was determined by using healthy leaves of the sweet and sour orange varieties, mandarin and lemon trees. The results showed the existence of native populations of antagonistic against INA bacteria including Bacillus sp. Enterobacter sp. Escherichia coli, Klebsiella sp. Micrococcus luteus, and an unidentified yeast. When antagonistic microorganisms were applied to the leaves of the healthy citrus trees, a reduction from 15 to 100 % in the frequency was observed of the frost damage. It was concluded that antagonic epiphytic microorganisms are an alternative to reduce frost damage of INA on citrus trees.

Key words: frost, citrus, phylloplane, epiphytic, stomata

Introducción y antecedentes.

En el estado de Nuevo León, México en 1988 una helada redujo drásticamente la producción anual de cítricos de 320 mil a sólo 5 mil toneladas. Este daño severo se asoció a la incidencia de bajas temperaturas, aunque se cree que influyeron factores biológicos como la densidad de las BANH, epifitas naturales de una amplia gama de plantas (Gross et al., 1984; Wilson y Lindow, 1994abc; Taiz y Zeiger, 1998). Se reporta que cuando las hojas de estas se exponen a temperaturas de congelamiento durante largos periodos de tiempo, aparecen cristales de hielo extracelulares que causan el movimiento de agua en estado líquido del protoplasto al exterior.

Esto provoca una deshidratación aguda si el congelamiento es rápido, los cristales se forman en el protoplasto de la célula vegetal y esta se muere (Hirano, et al., 1985; Weibell, et al., 1990; Blakeman, 1993; Mariano y McCarter, 1993).

Es evidente que la formación de los cristales de hielo depende de las propiedades físico-químicas del filoplano de la planta y del crecimiento de las BANH en esa zona. Algunas de las proteínas producidas por las BANH, tienen la función bioquímica de alinear las moléculas de agua entre las regiones de aminoácidos para dar origen a estos cristales (Wilson y Lindow, 1994c; Wilson et al., 1999).

Lo anterior explica la sensibilidad de las hojas de cítricos y gramíneas al congelamiento por heladas tempranas o tardías, asociado con el crecimiento de los ecotipos de las BANH en su filoplano (Wilson y Lindow, 1993; Yessad et al., 1994). Cuando la humedad relativa es superior al 80 % en el ambiente y la temperatura fluctúa entre el 5oC y 0oC, las BANH sintetizan estas proteínas a nivel de su membrana e inician la formación de cristales de hielo hacia el exterior (Sundin y Bender, 1993; Beattie y Lindow, 1994 abc).

Así congelan las hojas de la planta y causan pérdida de la producción agrícola como sucedió en la zona citricola del estado de Nuevo León. Los géneros de BANH representativos en el filoplano de plantas son: Pseudomonas syringae Van Hall (Hirano et al., 1985; Andersen et al., 1991), P. fluorescens (Mingula) biotipo G (Lindow, 1982; Lindow et al., 1993), P. viridiflava (Burkholder) Dawson, P. agglomerans (Lohis) Dya (Lindow et al., 1982), y P. sterwartii (Lindow, 1983a; Lindow et al., 1984). El efecto de las BANH puede ser un problema agrícola difícil de resolver, ya que la propiedad de formar núcleos de hielo es común entre los microorganismos nativos del filoplano de plantas domésticas (Lindow, 1982, 1987) y silvestres (Granados et al., 2000; 2005) Dado que la actividad de las BANH causa pérdidas económicas, se intenta reducirla en los cultivos agrícolas mediante el control químico con antibióticos de amplio espectro como la estreptomicina o la oxitetraciclina, así como con metales pesados del tipo del zinc (Zn2+) o el cobre (Cu2+), en ambos casos sin resultados satisfactorios (Lindow, 1983b; Andersen et al., 1991; Stromberg et al., 1999,2000).

Una alternativa distinta para su control es la aplicación de microorganismos antagonistas a las BANH (Lindow y Connel, 1984), como algunos bacteriófagos (Cody et al., 1987; Mariano y McCarter, 1993; Schnabel y Jones, 1999). En este tipo de tratamientos se reportan resultados positivos en la disminución del congelamiento de hojas de maíz, tomate, peral y cítricos (Anderson et al., 1984; Cody et al., 1987; Lindemann y Suslow, 1987), una eficacia relativa en la reducción del daño por congelamiento de entre un 60% un 70% (Lindow et al., 1977; 1978; 1981; 1982; 1983b) y sin efectividad cuando la reducción del daño fue menor al 10% (Lindow et al., 1982; 1983; Lindow, 1983a).

El antagonismo contra las BANH se induce por alteración de la ecología microbiana en el filoplano de la planta (Lindemann y Suslow, 1987; Lindow, 1987; Hirano et al., 1996).

Con microorganismos autóctonos para asegurar la competencia de esta población contra los ecotipos de las BANH y reducir el daño por congelamiento en el sistema foliar de la planta. Obviamente con aplicación de agentes químicos se eliminan parcialmente las poblaciones de BANH, pero causan contaminación ambiental y se afecta también a las poblaciones de antagonistas (Wilson y Lindow, 1992, 1993, 1994a). Por otro lado si se seleccionan microorganismos nativos del filoplano del cultivo vegetal que se pretende proteger de la población de BANH, esto permite disminuir el uso de agentes químicos contra las BANH y minimizar el daño por congelamiento en la hoja, sin causar contaminación ambiental.

Los objetivos de este trabajo fueron: 1) aislar microorganismos nativos de filoplano de cítricos antagonistas a las BANH: P. agglomerans y P. syringae; 2) determinar el efecto de estos antagonistas sobre la actividad de ecotipos de las BANH en hojas de cítricos.

MATERIALES Y METODOS

I. Origen aislamiento e identificación de los ecotipos de las BANH de cítricos.

En la primavera de 1992 y 1994 se aislaron del Municipio de General Terán, N.L. ecotipos de P. agglomerans a partir de hojas sanas de naranjo dulce (Citrus sinensis L.) de acuerdo con el procedimiento descrito por Cody et al., (1987). Las posibles BANH del filoplano de las plantas se aislaron y cultivaron en agar nutritivo (AN) por 24 h, posteriormente se suspendieron en 3.0 ml de cloruro de sodio (NaCl al 1.0% p/v) en agua destilada. Los ecotipos de las BANH se identificaron según el criterio del Manual de Bergey (Buchanan y Gibson, 1994). Se incluyeron dos ecotipos de las BANH de referencia: P. syringae cepas PssT y PssCB728a donadas por el Dr. Steven Lindow de la Universidad de California en Berkeley, CA, EUA.

II. Prueba de activación de núcleos de hielo de los ecotipos nativos "in vitro".

Para demostrar la capacidad de formación de núcleos de hielo por los ecotipos de las BANH, se utilizó la técnica establecida por Hirano et al. (1985). Los tubos con los ecotipos de las BANH se colocaron en un congelador (General Electric Mod. RGA-113) a 9°C para determinar su tiempo de congelamiento a intervalos de cinco minutos, según describen Lindow et al. (1982) y Wilson y Lindow, (1994b). En este ensayo se usaron como referencia de las BANH a las cepas y ecotipos de P. syringae (Psst y PssCB728a) y a los de P. agglomerans de la colección del laboratorio de microbiología ambiental del IIQB-UMSNH.

III. Aislamiento de los microorganismos antagonistas a los ecotipos de BANH.

Para hojas sanas de cítricos se suspendieron en matraces Erlenmeyer de 500 mL con 250 mL de amortiguador de fosfatos 0.1 M, pH 7.0 y 0.01 % de dodecil sulfato de sodio (SDS), los matraces se agitaron a 250 rpm/2h para separar y suspender sin dañar los posibles microorganismos nativos adheridos a las hojas, antagonistas a las BANH. El amortiguador se usó para humedecer cuatro discos de papel filtro (Whatman No.1) esterilizados, de 5 mm de diámetro. Estos se colocaron sobre la superficie de cajas Petri con agar antagonista (AA) (g/L): sacarosa 2.0, NaCl 5.0, MgSO4 7H2O 3.0, NH4Cl 5.0 y agar 18.0, previamente inoculadas con los ecotipos de las BANH P. syringae y P. agglomerans, después de que cada una se suspendió en solución salina 0.85% (NaCl p/v) a una concentración de 106 células/ mL, de acuerdo con el tubo No. 1 de Mac Farland. Cada suspensión se sembró (0.7/mL) en cajas con AA, que se incubaron a 30º C/24-48 h como lo reporta Lindow (1982).

IV. Antagonismo microbiano sobre el crecimiento de los ecotipos de las BANH "in vitro".

Para detectar la actividad de inhibición del crecimiento de los microorganismos antagonistas nativos de cítricos sobre los ecotipos de las BANH se utilizó la técnica de doble capa recomendada por Lindow et al. (1982, 1983) y Lindow, (1983ab). En este ensayo se combinaron 15 mL de AN y 1.0 mL de una suspensión de cada ecotipo de las BANH a una concentración de 1 x 106 UFC/mL/caja. Posteriormente se agregó una segunda capa de AN con 15 mL, que se mezclaron con 1.0 mL de los microorganismos de cítricos antagonistas a la misma concentración celular de los ecotipos de las BANH. Estas cajas se incubaron a 30°C/ 24-30 h y se registraron los halos de inhibición del crecimiento de las BANH, causado por los microorganismos antagonistas nativos del filoplano de los cítricos.

V. Efecto de los microorganismos antagonistas sobre los ecotipos de BANH en las hojas de cítricos.

Para este experimento se prepararon suspensiones de las BANH a una concentración de 1 x 107 y de los antagonistas 1 x 107 UFC/mL en un amortiguador de fosfatos 0.1M a pH 7.0. De ambas suspensiones se tomaron con pipetas Pasteur 18 gotas/hoja, cada gota equivalente a 100µl de 1 x 103 UFC, que se aplicaron sobre la superficie de hojas sanas de: naranjo dulce, naranjo agrio, mandarino y limón de acuerdo con la técnica de Hirano et al. (1985) y Donegan et al. (1991) luego se continuó con el procedimiento que se describió en el inciso II.

VI. Análisis estadístico.

Para establecer las diferencias de la actividad de la inhibición de los microorganismos antagonistas nativos de las hojas de cítricos sobre los ecotipos de las BANH de P. agglomerans y P. syringae se aplicó la prueba de Chi cuadrada (X2) y para validar la inhibición de estos antagonistas sobre la frecuencia de formación de núcleos de hielo, se empleó un diseño de bloques al azar con 34 tratamientos y 7 repeticiones (Steel y Torrie, 1985).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

I. Aislamiento de microorganismos antagonistas a los ecotipos de BANH

En el AA se detectaron bacterias antagonistas que causaron halos de inhibición del crecimiento de los ecotipos de P. agglomerans y de P. syringae, (Psst y PssCB728a), lo que sugiere que estos antagonistas liberaron sustancias tipo antibiótico aún no identificadas (Wilson y Lindow, 1983, 1987,1994b, 1994c, 1995; Lindow, 1983b, 1987). En el cuadro 1 se presenta el efecto de esos antagonistas sobre los ecotipos de P. agglomerans aislados de hojas de naranjo dulce (NI), el cual fue similar al que se detectó sobre las cepas y ecotipos de P. syringae, (Psst y PssCB728a). De acuerdo con el tamaño de la muestra se encontraron diferencias en el grado de competencia entre los antagonistas y su capacidad para inhibir el crecimiento de los ecotipos de las BANH: P. agglomerans y P. syringae, (Psst y PssCB728a) en el AA.

Estos resultados concuerdan con los reportados por Anderson et al. (1984); Cody et al. (1987) y Granados et al. (2000), quienes observaron diferencias en la actividad de los antagonistas, provenientes de diversas plantas, sobre el grado de inhibición del crecimiento de los ecotipos de las BANH, en medio de cultivo artificial. En estos trabajos se reporta que los antagonistas muestran mayor capacidad de inhibición bajo condiciones in vitro; mientras que en otros reportes de investigación en los cuales se intentó reducir el daño de las BANH con microorganismos antagonistas, en árboles frutales la inhibición fue menor Anderson et al. (1984) y Hirano et al. (1996).

El cuadro 2 presenta el efecto de los antagonistas del filoplano de cítricos sobre los ecotipos de P. agglomerans (L-1 y N-1) y de P. syringae. En este ensayo se encontró que excepto los géneros Escherichia y Klebsiella, las bacterias Gram negativas fueron antagonistas en diverso grado contra la población de las BANH. Confirma que el comportamiento de cada bacteria es dependiente del tipo y de la condición del medio de cultivo artificial.

Estos resultados difieren de los resultados que se observa en la superficie de la hoja en el campo. En el medio de cultivo los microorganismos antagónicos inhibieron a las BANH, lo cual se presume está asociado a la riqueza nutricional del AA, ya que los microorganismos no mostraron un efecto de inhibición similar sobre la población de las BANH en la hoja del cítrico, en donde probablemente la concentración y tipo de los exudados foliares no estimularon a las bacterias antagonistas y consecuentemente se redujo su impacto sobre la población de las BANH (Cody et al. 1987; Blakeman, 1993). Por otra parte los dos géneros Gram positivos Bacillus y Micrococcus fueron antagónicos para uno de los ecotipos de las BANH de P. syringae y/o P. agglomerans.

Es probable que su capacidad de inhibición contra la población BANH se relacione con su tolerancia a la radiación solar, pues se sabe que Micrococcus sintetiza un pigmento que le protege del efecto bactericida de la luz ultravioleta. En tanto que por la naturaleza de las esporas de Bacillus, estas son resistentes no solo a este factor físico, sino también a agentes químicos. Incluso en el caso de Bacillus, está reportado que utiliza los exudados foliares para colonizar y dominar esa zona de la planta, lo que explica su efecto de inhibición contra la población de las BANH y en consecuencia la reducción del daño por congelamiento sobre la hoja (Beattie y Lindow, 1994ab).

II. Efecto de los microorganismos antagonistas sobre los ecotipos de las BANH en las hojas de cítricos

El cuadro 3 resume el análisis de varianza del efecto de la inhibición de los microorganismos antagonistas sobre el crecimiento de los ecotipos de las BANH y sobre la frecuencia de formación de núcleos de hielo en las hojas de cítricos. Los resultados indican que no se detectó una diferencia significativa (p < 0.01) en el porcentaje de reducción de la formación de núcleos de hielo en las hojas de naranjo dulce, agrio y mandarino.

De forma análoga a lo reportado en: perales, manzanos y orquídeas (Gross et al., 1984; Donegan et al., 1991). No se observó efecto de los microorganismos antagonistas sobre la población de las BANH en la hoja de limón, probablemente por la incapacidad de los antagonistas para colonizar este tipo de hoja. También es probable que la población BANH fue más competitiva que la de los microorganismos antagonistas, por los exudados foliares del limón y en consecuencia se observó la muerte de la hoja por congelamiento (Beattie y Lindow, 1994 a, b, c).

Resultados semejantes se reportaron por Lindow (1981) y Gross et al. (1984), en hojas de árboles de manzano y de peral. En otros casos la inhibición de la frecuencia de nucleación fue de un 100%, como se señala en hojas de árboles frutales por Hirano et al. (1985, 1996). Lo anterior sugiere que en este grupo de microorganismos antagonistas nativos, existe el potencial para su aplicación, en la reducción del efecto negativo de los ecotipos de las BANH (Granados et al., 2000).

III. Caracterización bioquímica de los principales microorganismos antagonistas a los ecotipos de BANH

En el Cuadro 4 se presentan las pruebas bioquímicas que señalan que las bacterias antagonistas a los ecotipos de las BANH pertenecen a la familia de las enterobacterias (Buchanan y Gibson, 1994). Se identificaron tres géneros típicos Escherichia coli, Enterobacter spp. y Klebsiella sp; en general estas bacterias se reportan en el filoplano, solo cuando aguas negras mediante aerosoles las contaminan. Recientes investigaciones sugieren que en realidad estas bacterias son ubicuas (Costa y Loper, 1995; Barraquillo et al., 1997; Estrada-De los Santos et al., 2001).

La estrecha relación de estas bacterias antagonistas de las BANH con enfermedades gastrointestinales, limitan su posible aplicación para evitar el daño por congelamiento en hojas de las BANH (Lindow et al.,1993; Yessad et al., 1994). El género Bacillus sp. como se señaló previamente, tiene potencial para reducir el daño por congelamiento contra los ecotipos de las BANH, pues está demostrado que B. cereus coloniza y domina las hojas de plantas al utilizar probablemente sus exudados como fuente de carbono y energía (Lambert y Perferoen, 1992 y Beattie y Lindow, 1994a,b) y de esa forma impide el establecimiento de bacterias fitopatógenas de la hoja. Se cree que de esa forma Bacillus sp. probablemente evitó el daño por congelamiento en la hoja del cítrico, por los ecotipos de las BANH (Cody et al. 1987; Donegan et al. 1991; Hirano et al. 1996 Wilson et al. 1999).

La detección de inhibición del congelamiento en las hojas por una levadura no es usual, requiere de investigación para determinar su posible uso potencial contra el daño por congelamiento por la población de las BANH. En el caso de M. luteus este coco fue antagónico para ciertos ecotipos de la población BANH. Se supone que ello se debe en parte a que sintetiza un pigmento intracelular que lo protege de la acción bactericida de la radiación solar y la luz ultravioleta (Buchanan y Gibson, 1994). Los resultados de este trabajo sugieren que no todos los microorganismos antagonistas a las BANH de esta clase compiten por el espacio y los exudados del filoplano, como lo reportan Donegan et al. (1991) y Granados et al. (2000), ya que en algunos ensayos de antagonismo microbiano contra la población de las BANH para la reducción del daño por congelamiento en las hojas de cítricos, fue apenas de un 15%. Como lo reportado por Cody et al. (1987); Lindemann y Suslow (1987); Wilson y Lindow (1995) y Wilson et al. (1999) en hojas de árboles frutales, lo que indica que este no es un problema de fácil solución.

Los resultados de esta investigación apoyan la existencia natural de una amplia gama de microorganismos nativos del filoplano, de aplicación potencial antagonistas contra a los ecotipos de las BANH, como lo reportan Lindow y Connel (1984); Wilson y Lindow (1992; 1994a) y Yessad et al. (1994). Los ensayos realizados con estos microorganismos antagonistas contra ecotipos de población de las BANH, facilita la selección de aquellos con características adecuadas para su aplicación en ambientes agrícolas que sean inocuos a plantas, animales y humanos, de fácil cultivo en el laboratorio y de bajo costo de producción.

La aplicación de bacterias antagonistas nativas de hojas sanas, tiene ventajas sobre los microorganismos de los productos comerciales conocidos, ya que estos en algunos casos se basan en bacterias mutantes modificadas por ingeniería genética como: P. syringae (Lindow, 1987; Weibell et al., 1990; Varvaro y Martella, 1993; Wilson y Lindow, 1993, 1994b). No obstante la eficacia de estas mutantes para reducir el daño por congelamiento de las BANH en las plantas, su aplicación supone un riesgo, el cual aún no se sabe que tan grave puede ser por la falta de conocimiento sobre su posible impacto negativo al ambiente al dispersar estas bacterias en la naturaleza. Por ello se recomienda investigación al respecto en el agroecosistema para prevenir consecuencias indeseables (Lindeman y Suslow, 1987; Sunding y Bender, 1993; Wilson y Lindow, 1994 a, b, c). Se concluye que los microorganismos nativos antagonistas de las BANH pueden ser una opción para reducir su actividad detrimental, como se observa en la naturaleza.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo se dedica al Dr. Luis J. Galán-Wong, FCB-UANL quien sugirió trabajar con esta idea.

A la dirección general de Investigación Científica y Tecnología de la SEP a través de la FCB-UANL, por el apoyo económico. A la CIC de la UMSNH proyecto 2.7, (2002-2004) por las facilidades para su publicación. A la Dra. Lidia Solís del Lab. Fitopatología de la FCB-UANL por las facilidades logística y valioso tiempo, al MC Pedro Moreno-Zacarías por su asesoría en el análisis estadístico. A Beatriz Noriega-Gamboa por su paciencia en su escritura.

LITERATURA CITADA

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Cuadro 1. Efecto de microorganismos antagonistas de cítricos a una bacteria activadora de núcleos de hielo en el laboratorio.

xxOrigen del ecotipo: naranja dulce NI.

x2 =5.8 N.S. p>0.05G1=4

Cuadro 2. Inhibición de los ecotipos de bacterias activadores de núcleos de hielo por microorganismos antagonistas del filoplano de cítricos.

ahojas sanas de limón (L) y naranjo (N) bcepas de referencias. Lindow, U. de California, Berkeely, USA. (-) sin inhibición (+) inhibido.

Cuadro 3. Análisis de varianza del efecto de microorganismos antagonistas sobre la reducción del daño por congelamiento causado por BANHa en hojas sanas de cítricos.

**P<0.05, *P< 0.01, aBANH= Bacterias activadoras de núcleos de hielo: P. agglomerans, Pseudomonas syringae. * diferencia estadística. ** diferencia no significativa.

Cuadro 4. Caracterización bioquímica de las bacterias antagonistas de cítricos a los ecotipos de BANH: Pantoae agglomerans y Pseudomonas syringae .

*EMB= Agar Eosima azul de metileno para entéricas. Las pruebas bioquímicas se realizaron por triplicado, reacción: (-) = Negativo; (+) = Positiva. BANH= bacterias activadoras de núcleo de hielo 1 Psst y PssCBT28a.

1López-Granados, G;

2Fernández-Pavía, S..

3*Sánchez-Yáñez, J.M.

1Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Autónoma de Nuevo León. Apdo. Postal 414, San Nicolás de los Garza, N.L.

2Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo.Ave. Acueducto y Tzintzuntzan s/n. Morelia, Michoacán, 58240, México.

3Microbiología ambiental, Instituto de Investigaciones Químico Biológicas. Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. Edif. B-1, C.U. 58000. Morelia, Michoacán, México

*autor correspondiente