Variación de la Tasa de Enraizamiento Asociada al Número de Subcultivo y Diámetro de Microtallos de Castaño Castanea sativa Mill (página 2)

MATERIALES Y MÉTODOS

El estudio se llevó a cabo en el laboratorio de Biotecnología Forestal de la Universidad de Concepción, Concepción, Chile durante el año 2002. Se utilizaron microtallos de Castanea sativa Mill. generados a partir de cadenas proliferativas inducidas desde el cultivo de embriones maduros aislados, realizándose subcultivos en intervalos de cinco semanas. El material vegetal utilizado correspondió a aquel que tenía entre 7 y 12 subcultivos, en los cuales se clasificaron los microtallos según su diámetro de cuello, obteniendo tres clases diamétricas: < 1,5 mm; 1,5 – 3,0 mm; y > 3,0 mm.

Los microtallos de cada subcultivo y clase diamétrica se seleccionaron de acuerdo a características morfológicas (grado de desarrollo y turgor de las hojas, entre otras) y estado sanitario, con una longitud aproximada de 25 a 30 mm.

El medio de cultivo utilizado durante la etapa de proliferación fue el medio DKW, desarrollado por Driver y Kuniyuki (1984) para nogal (DKW) suplementado con 1 mg L-1 de 6-benzilaminopurina (BAP), 0,1 mg L-1 de ácido indol 3-butírico (AIB) y sacarosa (30 g L-1). El pH se ajustó a 5,8 y después de adicionar 7 g L-1 de Agar Agar, la mezcla se dispensó en recipientes de vidrio conteniendo 25 mL de medio, los cuales se esterilizaron en autoclave a 120°C y 1 atm de presión por 20 min.

El método de enraizamiento utilizado en este estudio correspondió al método de inducción rápida, recomendado por Dinamarca (2002). Para ello, se sumergió 1 cm de la parte basal de cada microtallo en una solución de AIB de 0,5 mg mL-1 por 15 min. Posteriormente, los microtallos se llevaron al medio de enraizamiento correspondiente a una mezcla de corteza de pino:perlita (4:1, v/v) previamente esterilizado en autoclave, dispuesta en una bandeja de plástico de color blanco de dimensiones (45 x 12 x 10 mm) con tapa transparente. Esta bandeja se colocó en cámara de cultivo a fotoperíodo de 16 h, con una intensidad lumínica de 3000 lux, temperatura de 25 ± 1°C día/ 22 ± 1°C noche, y humedad relativa aproximada de 40%. El riego se realizó cada tres días con agua estéril. La evaluación de los microtallos se realizó a los 20 días de cultivo. Las variables cuantitativas fueron: tasa de supervivencia (%), tasa de enraizamiento (%), número de raíces/microtallo y longitud de raíz más larga (mm). Las variables cualitativas fueron presencia o ausencia de callo, apariencia de los microtallos y apariencia del sistema radicular en cuanto a la fibrosidad y presencia de pelos radiculares y raíces secundarias. Se utilizó un diseño completamente al azar (Montgomery, 1991). En el caso de la supervivencia y la tasa enraizamiento las diferencias entre tratamientos se determinaron mediante la prueba de diferencia mínima significativa (P ≤ 0,05). La unidad muestral estuvo conformada por grupos de tres microtallos, realizando cinco repeticiones para cada tratamiento. Las variables largo de raíces y número de raíces por microtallo se analizaron sólo en base a microtallos enraizados y por tanto los tratamientos no tenían un número fijo de repeticiones, se utilizó la prueba de Duncan (P ≤ 0,05) (Montgomery, 1991), situación en que la unidad muestral correspondió al microtallo enraizado.

RESULTADOS Y DISCUSI*ÓN

Los resultados obtenidos muestran que la tasa de supervivencia de microtallos es afectada significativamente por el número de subcultivos (Cuadro 1). La mayor tasa de supervivencia al final del experimento se obtuvo con microtallos del octavo subcultivo. Por otro lado, los microtallos del subcultivo 12 sólo permanecieron vivos hasta los 20 días de cultivo. Estas observaciones confirmaron que el porcentaje de supervivencia declina con el aumento del número de subcultivos, lo que coincide con resultados obtenidos por Vieitez et al. (1985), quienes asocian este comportamiento al proceso de hiperhidratación que sufren los microtallos. En este estudio se evidenció hiperhidricidad a partir del subcultivo 10 (Figura 1a), identificándose como la principal causa de mortalidad de microtallos durante el  proceso de enraizamiento. La hiperhidricidad estaría relacionada con la concentración de citoquininas, auxinas e iones amonio, lo que generaría un efecto acumulado que provoca una disminución de la supervivencia de los microtallos durante el proceso de enraizamiento (Vieitez et al., 1985; Deberg y Maene, 1985 citado por Pâques y Boxus, 1987; Dencso, 1987).

Cuadro 1. Supervivencia (%), enraizamiento (%), número de raíces y largo de raíces (mm) de microtallos de Castanea sativa Mill. respecto del número de subcultivo. Table 1. Survival (%), rooting (%), number of roots and length of roots (mm) of microcuttings  of Castanea sativa Mill.  with respect to subculture number.

Figura 1. Aspecto de microtallos de Castanea sativa Mill. durante el proceso de enraizamiento: a) Microtallos provenientes del subcultivo 11 en proceso de hiperhidratación; b) Microtallo con necrosis apical; c) Microtallos enraizados sin desarrollo de brotes provenientes del subcultivo 7; d) Microtallos no enraizados con presencia de brotes y hojas provenientes del subcultivo 8; e) Plántula en proceso de aclimatación con desarrollo de hojas y brotes a los 70 días de cultivo.

Figure  1. Aspect of microcuttings of Castanea sativa Mill. during the rooting process: a) Hyperhydrated microcuttings coming from 11th subculture; b) Microcutting with apical necrosis; c) Rooted microcuttings without development of shoots from 7th subculture; d) Unrooted microcuttings  with the presence of shoots and leaves from 8th subculture; e) Rooting plantlet  with developing shoots and leaves after 70 days of culturing in the process of acclimatization.

El factor diámetro de los microtallos no presentó diferencias significativas, lo que indica que este factor no afecta el porcentaje de supervivencia durante el enraizamiento (Cuadro 2). Sin embargo, los resultados muestran una tendencia de aumento en la supervivencia respecto del aumento del diamétro de microtallo lo que podría explicarse porque, una mayor cantidad de tejido de reserva y mayor desarrollo y lignificación de los tejidos protectores, se evita la desecación (Ríos et al., 2002a), permitiendo una mayor supervivencia de los microtallos.

Cuadro 2. Supervivencia (%), enraizamiento (%), número de raíces y largo de raíces (mm) de microtallos de Castanea sativa Mill. respecto del intervalo diamétrico. Table 2. Survival (%), rooting (%), number of roots and length of roots (mm) of microcuttings  of Castanea sativa Mill.  with respect to interval diameter.

Otro aspecto importante fue el fenómeno de necrosis apical que se presentó en forma aleatoria en todos los tratamientos de enraizamiento ex vitro (Figura 1b). Este hecho ha sido reportado en condiciones in vitro por Dinamarca (2002), Micheli et al. (1993), Piagnani et al., (1996), Ríos et al. (2002b), Sánchez et al. (1997) y Vieitez et al., (1985) en las etapas de multiplicación, elongación o enraizamiento, produciéndose pérdida de un gran número de propágulos. Sin embargo, en Castanea sativa no existen estudios que reporten dicho comportamiento en condiciones de enraizamiento ex vitro, por lo que es posible inferir que este fenómeno es independiente a las condiciones de enraizamiento, pero dependiente del genotipo (Piagnani et al., 1996), por lo que se explicaría el comportamiento aleatorio en la presencia de la necrosis apical en los microtallos provenientes de cultivo de embriones.

Porcentaje de enraizamiento y número de raíces

Los tratamientos que respondieron al proceso de enraizamiento, presentaron las primeras raíces entre los 10 y 12 días después de la inducción radicular, lo que coincide con los resultados obtenidos por Vieitez y Vieitez (1982) y por Dinamarca (2002).

El análisis del número de subcultivo respecto al porcentaje de enraizamiento, indica que existen diferencias significativas entre los distintos niveles (Cuadro 1). El mayor porcentaje de plantas enraizadas se obtuvo en el subcultivo 8. Por el contrario, el valor más bajo se alcanzó en el subcultivo 12. Los resultados mostraron que en una primera etapa, el porcentaje de enraizamiento ex vitro aumenta hasta alcanzar los subcultivos 8, 9 y 10 para luego descender en los subcultivos siguientes. Esta tendencia coincide con lo reportado por Sánchez et al. (1997) para enraizamiento in vitro de microtallos de C. sativa, quienes evaluaron este proceso organogénico desde el primero al sexto subcultivo, siendo este último el que presentó el mayor porcentaje de enraizamiento.

La disminución del porcentaje de enraizamiento a partir del subcultivo 10, estaría relacionado con el proceso de hiperhidratación que se observa en microtallos cultivados in vitro durante el proceso de enraizamiento (Vieitez et al., 1985), y que afecta negativamente el número de microtallos enraizados a medida que aumenta el número de subcultivos. Esto se relaciona también con los estudios realizados por Vidal et al. (1994), quienes encontraron que la concentración de BAP es inversamente proporcional al enraizamiento en microtallos de C. sativa. Este resultado, en particular, permite deducir que el efecto de subcultivos sucesivos, con microtallos expuestos por un mayor tiempo a altas concentraciones de citoquininas durante la fase de multiplicación, se traduce en un menor porcentaje de enraizamiento.

Un hecho importante es aquel que indica que la mayoría de los microtallos enraizados (Figura 1c) no presentaron desarrollo de brotes y hojas, en contraste con los microtallos no enraizados (mayoritariamente del subcultivo 8 en adelante), los cuales presentaron en general buen desarrollo de brotes y hojas (Figura 1d). La ausencia de crecimiento y desarrollo tanto de nuevos brotes como de hojas, ha sido asociada a los efectos de cambios en la relación citoquinina/auxina endógenas, lo cual está asociado a la inducción rizogénica mediada por AIB, reduciendo los niveles endógenos de la relación, situación que también ha sido observada en nogal (Juglans regia L.) (Sánchez-Olate, 1996). En el análisis bioquímico realizado por Vidal et al. (1994), se encontró que un alto coeficiente de multiplicación asociado a elevados contenidos de citoquininas endógenas, resulta en una baja tasa de enraizamiento, lo que explicaría la ausencia de raíces en microtallos con buen desarrollo de brotes y hojas. La cuestión es que si existen microtallos que no enraizan con aplicación de AIB en las concentraciones analizadas, podría indicar que se evidencian microtallos con requerimientos diferenciales de niveles endógenos de auxina, lo que no fue posible evaluar en la fase de selección de los microtallos para el proceso de rizogénesis adventicia analizado aquí. Asimismo, observaciones preliminares muestran que los microtallos enraizados de todos los tratamientos, logran la inducción de brotes y hojas a partir de los 70 días de cultivo (Figura 1e), momento en el cual el sistema radicular está en pleno desarrollo y expansión.

Respecto al análisis del diámetro de microtallo, éste no arrojó diferencias significativas entre los diferentes niveles (Cuadro 2). Lo anterior indicaría que el diámetro no influye en el enraizamiento de microtallos de Castanea sativa. Por su parte, el número de subcultivo se encuentra ligado al número de raíces por microtallo enraizado (Cuadro 1), ya que los resultados muestran diferencias significativas entre los subcultivos 7 (2,83 raíces por microtallo) y 8 (1,35 raíces por microtallo). Estos resultados coinciden con aquellos descritos por Sánchez-Olate (1996) para Juglans regia, quien obtuvo un mayor número de raíces en el sexto subcultivo.

No se encontraron diferencias significativas entre los distintos diámetros analizados; sin embargo se observó una tendencia al aumento del número de raíces, conforme aumenta el diámetro del microtallo (Cuadro 2). Esta situación ha sido descrita anteriormente, asociándose a una mayor cantidad de tejidos de reserva que contienen los microtallos más gruesos, lo que favorecería el desarrollo de las raíces (Hartmann y Kester, 1998; Ríos et al., 2002a).

Largo de raíces

La longitud de las raíces inducidas y manifestadas al final del ensayo, muestra diferencias significativas respecto de la variable número de subcultivo (Cuadro 1). Los subcultivos 8, 9, 10 y 11 no difieren entre sí; sin embargo, el subcultivo 7 presentó diferencias significativas respecto de los anteriores y alcanzó 16,7 cm.

La variable longitud de raíces no presenta diferencias significativas con respecto al diámetro del microtallo, (Cuadro 2). Esta respuesta puede estar ligada al hecho que tallos más gruesos disponen de mayor cantidad de sustancias de reserva para aportar durante la fase de inducción y manifestación radicular (Sánchez-Olate, 1996; Ríos et al., 2002a), al igual como ocurre con el número de raíces por microtallo. Finalmente, se observó que las raíces desarrolladas fueron gruesas, de aspecto fibroso y sin pelos radiculares, todo ello independiente del diámetro y del número de subcultivo (Figura 1c).

CONCLUSIONES

La mayor tasa de enraizamiento ex vitro se obtiene entre los subcultivos 8 y 10, siendo los subcultivos 11 y 12 significativamente menores.

El diámetro de microtallo utilizado no influye significativamente en la tasa de enraizamiento, supervivencia y número y largo de raíces adventicias originadas.

RECONOCIMIENTOS

Los autores de la presente investigación agradecen a la Dirección de Investigación de la Universidad de Concepción por el apoyo brindado a nuestra línea de investigación mediante el Proyecto DIUC 99.140.007.1-0.

LITERATURA CITADA

Benedetti S., y M. Subiri. 2000. El castaño: una opción de producción forestal. 112 p. Ediciones LOM Ltda., Santiago, Chile.

Dencso, I. 1987. Factors influencing hiperhidratation of carnation and conifers. Acta Hortic. 212:167-176.

Dinamarca, P. 2002. Enraizamiento in vitro de microtallos de Castanea sativa Mill. Memoria de Título. 64 p. Universidad de Concepción, Facultad de Ciencias Forestales, Concepción, Chile.

Driver, D., and D. Kuniyuki. 1984. In vitro propagation of Paradox walnut rootstock. HortScience 19:507-509.

Gonçalves, J., G. Diogo, M.T. Coelho, and S. Amancio. 1998. Effect of rooting conditions on survival and growth during acclimatization of micropropagated chestnut plants (Castanea sativa x Castanea crenata). Act. Hortic. 494:235-241.

Hartmann, H. y D. Kester. 1998. Propagación de plantas: Principios y prácticas. 760 p. Editorial Continental, Ciudad de México, México.

Loewe, V., A Neuenschwander, y C. Alvear. 1995. El castaño en Chile: un cultivo fruto-forestal promisorio. Estudio de casos y análisis financiero. Informe Técnico N° 136. Instituto Forestal (INFOR). Santiago, Chile.

Loewe, V., M. Toral, M. González, G. Pineda, C. Delard, M. Subiri, et al.. 1998. Silvicultura de especies no tradicionales: una mayor diversidad productiva. Informe Final. 129 p. Documento de Trabajo N° 199. INFOR. Santiago.

Micheli, M., V. Perrone, y A. Standardi. 1993. Possibilita’ applicative della micropropagazione del castagno (Castanea sativa Mill.). Estratto de Cellulosa e Carta Nº 5. p. 18-23.

Montgomery, D. 1991. Diseño y análisis de experimentos. 589 p. Grupo Editorial Iberoamericana S.A., México.

Pâques, M. and Ph. Boxus. 1987.  Hiperhidratation: a review of literature. Acta Hortic. 212:155-166.

Piagnani, C., G. Zoccchi, and I. Mignani. 1996. Influences of Ca2+ y 6-benziladenine on chestnut (Castanea sativa Mill.) in vitro shoot-tip necrosis (Abstract). Plant Sci. 188:89-95.

Pierik, R. 1990. Cultivo in vitro de las plantas superiores. 326 p. Ediciones Mundi-Prensa, Madrid, España.

Ríos, D., M. Sánchez-Olate, M. Gea, y R. Rodríguez. 2002a. Nuevos sistemas experimentales para el estudio de la rizogénesis en nogal. Agrociencia 17:221-227.

Ríos, D., M. Sánchez-Olate, R. Hasbún, y R. Escobar. 2002b. Estudios morfofisiológicos de la propagación in vitro de castaño (Castanea sativa Mill.). In Primer Congreso de las Ciencias Forestales Octubre. Universidad de Chile,  Santiago, Chile.

Sánchez, M. C., A. Ballester and A.M. Vieitez. 1997. Reinvigoration treatments for the micropropagation of mature chestnut trees. Ann. Sci. For. 54: 359-370.

Sánchez-Olate, M. 1996. Bases macromorfológicas y moleculares de la macropropagación de nogal (Juglans regia L. cv. Serr). 203 p. Tesis Doctoral. Universidad de Oviedo, España.

Sierra, C. 2001. Propagación vegetativa de Castanea sativa Mill. y Juglans regia L., a través de estacas. 48 p. Tesis de Ingeniero Forestal. Universidad de Concepción, Facultad de Ciencias Forestales, Concepción, Chile.

Vidal, N., A. Ballester, M.C. Vieitez, C. Kevers, and Th. Gaspar. 1994. Biochemical characteristics of chestnut shoots related to in vitro multiplication and rooting capacities. Adv. Horticultural Science.8:19-24.

Vieitez, A.M. and M.L. Vieitez. 1982. Castanea sativa plantlets proliferated from axilary buds cultivated in vitro. Sci. Hortic. (Canterbury, Engl.) 18:343-351.

Vieitez, A.M., A. Ballester, M.C. San José, and E. Vieitez. 1985. Anatomical and chemical studies of vitrified shoots of chestnut regenerated in vitro. Phiysiol. Plant. 65:177-18.

Darcy Ríos L.1, Fabiola Avilés M.1, Manuel Sánchez-Olate1, René Escobar R. 1 y Guillermo Pereira C.21 Universidad de Concepción, Facultad de Ciencias Forestales, Victoria 631, Concepción, Chile. 2 Universidad de Concepción, Departamento de Ciencias Forestales, Unidad Académica Los Angeles, Casilla 341, Los Ángeles, Chile.