Detección y distribución de la población bacteriana activadora de núcleos de hielo en cítricos

1. Resumen
3. Materiales y métodos
4. Resultados y discusión
5. Conclusión
6. Literatura citada

RESUMEN

Las heladas afectan la producción agrícola nacional que ocasiona pérdidas económicas. Se le consideraba un problema de origen climatológico; investigación de los últimos 20 años determinó que existen agentes biológicos en la superficie de las hojas de plantas que las sensibilizan a la baja temperatura y que les causan daño por congelamiento, dado el impacto económico de las heladas en la zona cítrica del estado de Nuevo León.

El objetivo de ésta investigación fue determinar la densidad de la población bacteriana activadora de núcleo de hielo (BANH) en hojas sanas de cítricos, así como su identificación bioquímica. Para ello se colectaron hojas sanas de cítricos de los municipios de Monterrey: El Cercado, Villa de Santiago y Gral. Terán, N.L. A las bacterias aisladas de las hojas se les realizó la prueba activación de núcleos de hielo (ANH), de las cuales el 84% fueron positivas, en un tiempo promedio de 20 – 30 minutos.

Las poblaciones fluctuaron desde 5.0X102 hasta 6.1X106UFC/g de hoja fresca. Con respecto a su identificación bioquímica se detectaron géneros bacterianos diferentes a los reportados como BANH: Citrobacter sp., Alcaligenes sp y Xanthomonas sp. Se concluye que existen poblaciones de BANH, epifitas en las hojas de cítricos de N.L. Además de que la densidad de las BANH está influenciada por la localización geográfica de los huertos, el clima y el estado fisiológico de los árboles de los cuales se colectaron las hojas. Por ello es posible suponer que estuvieron involucradas en las heladas de la zona de 1993 y 1994.

Palabras claves: Biocongelamiento, filoplano, heladas tempranas.

DETECTION AND DISTRIBUTION OF TO NUCLEATION ACTIVE BACTERIA ON CITRIC OF NUEVO LEÓN, MÉXICO.

ABSTRACT

Freeze season cause damage and economical on the national agriculture production. Freeazing was regard as climatological problem research during las 20 years, found out that biological agents are involved on the pylosphere of leaf of plants. Those bacteria sensiblizing vegetables to freeze. Since in Nuevo Leon State caused negative impact in citric production are the aim of this reaserch were to determine the density of ice nucleation active bacteria (BANH) on healthy citric leaves as well as its identification biochemical there for were collected healthy leaves from counties: Monterrey, El cercados Villa de Santiago and Gral Teran N. L. Bacteria isolated from healthy leaves fuere testing for ice nucleation activity 83% fuere positive in around 20-30 min Variation of INA population indicated 5.0 X102 – to 1X106 CUF/g fresh leaf. Biochemical identification showed different bacterial genus Citrobacter sp, Alcaligenes sp as those reported m literature it conclude that INA bacteria dependent on climatologically regain as well as geogrical.

Therefor is believed that this type of bacteria were in volved in freeze problem in this are between 1993 and 1994.

Key word biological zea freeze phylloplane, early freesze.

INTRODUCCIÓN

Las pérdidas en los árboles de la zona cítricola del estado de Nuevo León, México; fue grave en los años (1993-1994), por la incidencia de heladas tempranas y tardías, pues los inviernos en ésta región son variables, además del fruto otras partes del árbol sufren daño: follaje, yemas, brotes florales e incluso la madera en función de la intensidad y duración de la helada. En consideración a reportes publicados por diferentes investigadores relacionados con el efecto de las bajas temperaturas en cultivos regionales, se sabe que existe un factor biológico que acentúa el daño por heladas (Beattie y Lindow 1994; Donegan et al., 1991, ); éste factor se refiere a la sensibilización de las hojas cultivos agrícolas por BANH/saprofitas y que se reproducen en ciertas épocas del año como la temporada de lluvia y al inicio de la estación de invierno, el pronostico de heladas temprana y tardía depende de la densidad de la población de BANH (Gross et al., 1984; Hirano et al., 1996: Lopez et al., 2005). Los objetivos de este trabajo fueron: i) Determinar la densidad de bacterias activadoras de núcleo de hielo de esos cítricos y ii) Identificar bioquímicamente los principales grupos bacterianos con esta capacidad en las hojas de cítricos de esa región.

MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 Origen de las muestras

Se colectaron hojas sanas de cítricos colectadas en las localidades de Monterrey, El Cercado, Villa de Santiago y General Terán, municipios del sur del estado de Nuevo León, Mèxico en los meses de Marzo, Abril y Mayo de 1994 y 1995. Las hojas se almacenaron en bolsas de plástico en refrigeración (5°C) hasta su procesamiento (Lindow, 1983).

3.2 Detección y enumeración de la población BANH.

Se colocaron 2.5 g de hojas sanas y frescas en 47.5 ml de amortiguador de fosfato 2.0 M pH 7.0 esterilizado y que se dejaron en agitación rotatoria a 250 rpm durante 1-2h, la suspensión se diluyó hasta 10-4 y se inocularon 0.2 ml por cuadruplicado en agar D-3 y en D-4, ambos se incubaron a 28+°C/48h (Lindow et al., 1982), para determinar la densidad BANH y se seleccionaron colonias características de Pseudomonas syringae por el pigmento verde extracelular y de Erwinia herbicola por el pigmento naranja intracelular. A los aislados se les asignaron las claves: S-5, Q-5, S-567, X-5M, X-10A, X-9A, X-3, X-a, C-13N, C-8, X-7, C-4c1, T-13VL, C-4B, R-2b; para su posterior identificación se resembraron en tubos de 18×150 con agar nutritivo-glicerol y guardaron en refrigeración para su preservación (15°C).

3.3 Medios de cultivo para el aislamiento de BANH.

a) Agar D-4 para Pseudomonas syringae.

Agar D-4 (g/L): peptona de gelatina 6.0; extracto de levadura 3.0; extracto de carne de res 1.5; agar-agar 15.0; pH 7.2, 30 mg de SDS (Dodecil sulfato de Sodio) y 1000 ml de agua destilada (Wilson y Lindow, 1993).

b) Agar D-3 para Erwinia herbicola.

Agar D-3(g/L); NaCl 5.0; (MgSO4.H2O) 0.3; NH4Cl 5.0; azul de bromotimol 0.06 fuschina ácida 0.1; sacarosa 20.0 agar-agar 20.0. 1000 ml de agua destilada.

3.4 Prueba para determinar la actividad de formación de núcleos de hielo (ANH).

Los aislados de Pseudomona y Erwinia se activaron en agar nutritivo por 48h/30°C, posteriormente se tomo una asada de éstos y se suspendió en tubos de 13X100 con 5 ml de solución salina sobresaturada esterilizada (usada como control negativo) y otro tubo sólo con agua destilada (usada como control positivo) se colocaron en un recipiente, que se mantuvo en congelador a temperatura de -7 y -8°C. Se registro el tiempo hasta que el tubo control negativo congeló, los tubos con aislados bacterianos que no se congelaron durante éste período, se consideraron negativos para la formación de núcleos de hielo (Hirano et al., 1996).

3.5 Descripción morfológica colonial, microscópica y bioquímica de las BANH.

Los aislados BANH se identificaron en base al esquema del manual de Bergey (2000) y Lindow, 1982; Wilson y Lindow, 1993).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 Densidad de la población bacteriana activadora de núcleo de hielo (BANH).

El cuadro 1 muestra la densidad de la población BANH detectadas en la filósfera de hojas sanas de cítricos, colectadas en los municipios de Monterrey, El Cercado, Villa de Santiago y Gral. Terán, N.L. al noreste de la republica mexicana o México; la que fluctuó desde 5.0X102 hasta 6.1X106 UFC/g de hoja fresca, como lo reportan Hirano et al., (1996).

4.2. Prueba para determinar la actividad de formación de núcleos de hielo en las bacterias recuperadas.

En ésta prueba se observó que un alto porcentaje de las bacterias aisladas (84%) fueron positivas a la actividad de formación de núcleos de hielo, en un tiempo promedio de 20 a 30 minutos. El mayor porcentaje de aislados positivos a la prueba, se recuperaron en el Agar D-4, como se reporta en cultivos agrícolas similares en los Estados Unidos (Hirano et al., 1996; Lindow, 1983), como se presenta en el cuadro 1.

Cuadro 1. Población de las bacterias activadoras de núcleos de hielo (BANH) en las hojas de cítricos del estado de Nuevo León. México.

ND: No determinada; V de Stgo. = Villa de Santiago, (-): Sin crecimiento. Todos los valores son el promedio de 4 repeticiones.

En particular en las hojas de los cítricos de los huertos de General Terán, se detectó una densidad de población de BANH desde 4.4X104 hasta 6.1X106 UFC/g de hoja fresca; en hojas de los cítricos del Cercado y Villa de Santiago desde 5.0X102 hasta 3.5X104 UFC/g de hoja fresca y la menor densidad poblacional se detectó en las hojas de la vegetación de los huertos del municipio de Monterrey, la que fluctuó desde 5.0X102 hasta 7.0X103 UFC/g de hoja fresca.

Estos resultados sobre la densidad de la población BANH indican su variabilidad en la zona cítricola del estado de Nuevo León, al noreste de la republica mexicana o México, probablemente porque las hojas analizadas se colectaron en cuatro áreas geográficas distintas. Lo anterior concuerda con lo reportado por Lindow (1982) y Gross et al., (1984), y Lopez et al (2005) al investigar BANH en hojas de plantas de distribución geográfica contrastante.

En general la densidad de las BANH epifitas en plantas, se reporta evidentemente influenciada por la condición ambiental que prevalece en el hábitat, al que parece la vegetación esta específicamente adaptada (Donegan et al., 1991; Hirano et al., 1985).

4.3 Identificación de las BANH.

En el cuadro 2 se presenta la división de los aislados en cuatro grupos morfológicos coloniales: amarillas, naranjas, blancas y verdes (verde translúcido y limón). Las características microscópicas de los aislados fueron: bacilos cortos y rectos Gram Negativos, con excepción de un aislado que dio Positivo a la reacción al Gram, forma cocos arreglados en tétradas.

Estas características morfológicas microscópicas y coloniales corresponden a BANH de las reportadas en la literatura (Blakeman, 1993; Buchanan y Gibson, 2000). Las colonias sospechosas de BANH fueron positivas en un 84% para la prueba de formación de núcleos de hielo, aunque ello también fue variable, lo que indica que existen diferentes ecotipos de géneros y especies bacterianas implicadas (Hirano et al., 1985), ya que cada área geográfica es distinta, al igual que las variedad de cítricos (Andersen et al., 1991; Blakeman, 1993: Lopez et al ., 2005).

Se observó que la selectividad de los medio de cultivo empleados no fue una limitante para la detección de otros géneros y especies de BANH (Lindow et al., 1982; Wilson y Lindow 1992), tales como: Citrobacter sp. y Alcaligenes sp, en Agar D-3 y Xanthomonas sp, en D-4, además de cuatro aislados que no se identificaron como se reporta en otros cultivos vegetales (Stromberg, et al., 1999). En está investigación se esperaba encontrar sólo BANH ampliamente conocidas: P. syringae y E. herbicola, según los numerosos reportes son las principales responsables de la sensibilización de hojas de plantas a heladas tempranas y tardías (Hirano et al., 1996; Wilson et al., 1999). Puesto que son epifitas comunes de hojas de plantas incluso en ornamentales (Hirano et al., 1996; Londow, 1983) y de valor comercial (Beattie y Lindow, 1994; Buchanan y Gibson, 2000). La detección de BANH diferentes a las reportadas se explica en base a la temperatura del ambiente, el clima de la región (Blakeman, 1993; Lopez et al., 2005), por su capacidad de supervivencia (Donegan et al., 1991) así como por su compleja interacción con las hojas de sus plantas hospederas (Hirano et al., 1985; Wilson et al., 1999).

Aunque la actividad de nuclear hielo de origen biológico se conoce en los Estados Unidos desde 1974 en daño a cultivos agrícolas (Lindow, 1982; Lindow et al., 1982), los resultados de ésta investigación representan uno de los pocos reportes sobre la distribución y densidad de BANH en la zona citrícola del noroeste de México y su posible correlación con el daño por heladas en cultivos citrícolas.

En el cuadro 3, se presentan las características de BANH aisladas en D-4, de los cuales tres liberaron un pigmento extracelular fluorescente verde; el aislado Q-5, fue oxidasa positiva, móvil, redujo nitratos, fue catalasa positiva, utilizó el citrato como fuente de carbono y fermentó la glucosa con formación de ácido. El aislado S-567 fue oxidasa positiva, formó levano, hidrolizó la gelatina, produjo ácido sulfhídrico, fue catalasa positiva, utilizó el citrato como fuente de carbono y redujo nitratos. Se recuperó un aislado que mostró respuesta bioquímica semejante al aislado S-567 (con excepción de la oxidasa débil) sólo que su morfología colonial fue diferente, lo que sugiere se trata de bacterias relacionadas y reportadas con BANH (Buchanan y Gibson, 1994; Gross et al., 1984).

Cuadro 2. Características morfológicas microscópicas y coloniales de las bacterias activadoras de núcleos de hielo (BANH) en la filósfera de hojas de cítricos del estado de Nuevo León.

NI: No identificada.

Cuadro 3. Características bioquímicas de las BANH de hojas de cítricos del estado de Nuevo León, México, relacionadas con Pseudomonas syringae.

Simbología:(+) = Positiva, (-) = Negativa, (+a) = positiva débil, a todos los resultados son promedio de 4 replicas. x Cepa de referencia.

En el cuadro 4 se muestran las BANH detectadas en el Agar D-3; mostraron características semejantes al género Erwinia herbicola (Beattie y Lindow, 1994), éstos fueron los aislados designado como: X-10A, X-9A, X-3 y X-8A negativas a la prueba de oxidasa; cuatro formaron levano y pigmento amarillo a 30°C; crecieron en anaerobiosis, utilizaron el malonato como fuente de carbono, algunas hidrolizaron la gelatina, pero no la caseína, ni el almidón, fueron variables en la reducción de nitratos, así como a la reacción de MR-VP, a la utilización de citratos, ninguna creció en KCN y la mayoría fermentó glucosa, lo que representa un grupo diferente al conocido de BANH del tipo P. syringae (Hirano et al., 1985; Lopez et al., 2005).

Cuadro 4. Características bioquímicas de ecotipo de Erwinia herbicola de BANH aisladas de hojas de cítricos del estado de Nuevo León, México.

Simbología:(+) = Positivo, (-) = Negativo, (+/-) = Ligeramente positivo, a todos los valores son el promedio de 4 repeticiones, x Cepa de referencia.

En cuadro 5 se muestran las características bioquímicas de los aislados C-13N, C-8 y X-7 de los cuales C-13N y X-7, mostraron respuesta bioquímica semejante: no crecieron en anaerobiosis, no redujeron nitratos, utilizaron el citrato y el malonato como fuente de carbono, fueron oxidasa negativa y no formaron acetimetilcarbinol (VP); el aislado C-8 no liberó levano, fue positivo al indol, creció en anaerobiosis y fermentó la glucosa en TSI (Beattie y Lindow, 1994; Buchanan y Gibson, 1994, Lopez et al., 2005) lo que indica que ninguno pertenece a E herbicola.

Cuadro 5 Características bioquímicas de las BANH diferentes de P. syringae y E herbicola de hojas de la zona citrícola del estado de Nuevo León, México.

Simbología:(+) = Positivo, (-) = Negativo, ND = No determinada, a todos los valores son el promedio de 4 repeticiones.

El cuadro 5 muestra otros aislados de BANH recuperados en D-3 fueron: C-4cl, fue móvil C-4B y R-2b diferentes a P. syringae y E. herbicola. El aislado C-4cl formó levano, hidrolizó la gelatina, catalasa y citrato positivo y el resto de las pruebas bioquímicas negativas. El aislado C-4B fue móvil formó pigmento amarillo a 30 °C, creció en anaerobiosis, redujo los nitratos, fue catalasa positiva y utilizó el malonato, el resto fueron negativas. El aislado R-2b fue semejante en algunas respuestas al aislado C-4B, como en la formación de pigmento a 30°C, el crecimiento en anaerobiosis y la reducción de nitratos, pero diferente en la prueba MR donde fue positiva y la VP negativa, fermentó los azúcares en el TSI, las restantes pruebas fueron negativas.

Cuadro 6. Características bioquímicas de las BANH diferentes de Peudomonas syringae y Erwinia herbicola y no identificadas aisladas de hojas de cítricos del estado de Nuevo León.

Simbología:(+) = Positivo, (-) = Negativo, (+/-) = Ligeramente positivo, ND = No determinada, a todos los valores son el promedio de 4 repeticiones.

El aislado T-13VL, en D-4, tuvieron una morfología microscópica de cocos arreglados tétradas Gram Positivos y con las siguientes características bioquímicas: catalasa positiva, oxidasa negativa, el malonato ligeramente positivo y fermentó los tres azúcares del TSI, no creció en anaerobiosis no redujo nitratos, no utilizó los citratos, inmóvil, ni produjo levano esto apoya que este patrón no corresponde a E. syringae ni E. herbicola y sugiere que la población de BANH es mas diversa de lo que se reporta.

CONCLUSIÓN

La densidad de las poblaciones BANH fue aparentemente influenciada por la localización geográfica de los huertos, las condiciones ambientales y el período de crecimiento de los árboles. Se detecto una densidad variable de las bacterias activadoras de núcleo de hielo epifitas en la superficie de las hojas de cítricos del estado de Nuevo León. Se identificaron P. syringae y E. herbicola y otros géneros bacterianos no reportados comúnmente con capacidad activadora de formación de núcleos de hielo tales como: Citrobacter sp., Alcaligenes sp. y Xanthomonas sp, lo que sugiere que probablemente en las heladas tempranas y tardías se involucra un grupo más complejo que lo reportado.

AGRADECIMIENTOS

A la dirección general de Investigación Científica y Tecnología de la SEP a través de la FCB-UANL, por el apoyo económico. A la CIC UMSNH, proyecto 2.7 (2005-2006) por las facilidades para su publicación. A Yasmín Lilian García Espinosa por su paciencia en su escritura.

LITERATURA CITADA

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* A.M Banda.,

** S.L.N González.,

+S Fernandez P

*** J.M Sánchez-Yánez.*

+Microbiología Industrial y Suelo.,

** Fitopatología., Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Autónoma de Nuevo León, Apdo. Postal 414, San Nicolás de los Garzas N.L, Mèxico.

+Fitopatologia Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales.

*** Microbiología ambiental,

*+autor correspondiente,

Ed. B-1. Instituto de Investigaciones Químico Biológicas. Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Morelia, Mich. cp 58030. México.