Producción de etanol por Zymomonas spp (página 2)

Material y métodos

Origen de las Zymomonas spp.

Muestras de jugos naturales frutos vegetales se colectaron en frasco estéril de 50 ml, transportadas en hielo al laboratorio para su procesamiento.

Detección de Zymomonas spp.

Se realizó en tubos en CELMG o caldo extracto de levadura g/L: 3g, extracto de malta 3, peptona de caseina 5, glucosa 20; 100 ppm de cicloheximida y 3% de etanol, a un de pH 5.0 ajustado con ácido láctico, c/tubo con un Durham invertido. Los tubos se incubaron a 30°C/24 a-48 h, la presencia de Zymomonas se detectó por producción de gas y la morfología típica: diplobacilos cortos Gram Negativos. Este etapa se repitió para su aislamiento en cultivo axénico.

Aislamiento de Zymomonas spp.

Los tubos positivos en la etapa anterior, se sembraron en cajas de Patri con agar (1.5%) y ELMG incubadas a 30°C/24-48h. Se seleccionaron aquellas colonias típicas de Zymomonas y por resiembra en el ELMG sin etanol en placa, así se obtuvieron los cultivos axénicos (5,20).

Identificación de los aislados.

Se uso el Manual de Bacteriología Determinativa de Bergey’s novena edición del 2000 (1). Con base en las pruebas para la identificación de Zymomonas sp se incluyo la cepa de colección Z. mobilis ATCC 10988 como patrón de referencia y comparación (3).

Conservación de los aislados.

Los aislados al igual que la cepa de colección de Zymomonas, se resembraron mensualmente en agar ELMG, sin etanol con cicloheximida y conservaron a 10°C en refrigeración.

Producción de etanol.

Para comprobar la capacidad de síntiesis de etanol de los aislados de Zymomonas, se siguió el siguiente protocolo: Fermentación. Los aislado se activaron en CELMG sin etanol y cicloheximida, se incubaron a 30°C/24-48h, posteriormente se tomó una asada de c/u para sembrar un matraz de 500 ml con 250 ml de CELMG, el cual se incubo a 30°C, a 100 rpm en agitador rotatorio/24-48h, de esté se sembró otro matraz con CELMG para la síntesis de etanol. Producción de etanol. Cada aislado activado en CELMP, se uso el 5% (v/v) de i para un matraz de 250ml. con 150ml. de medio de producción de etanol g/L: KH2PO4 2, extracto de levadura 10 y 10, 30, 50, 100 y 150. de glucosa en agua destilada a pH 5.0 ajustado con ácido láctico, las sales se agregaron después de esterilizar la base (17-21), cada aislado se sembró por triplicado, en condición estática y en agitación a 100 rpm a 30°C por 120 h se tomaron 5ml cada 24 h. en tubos con tapón de rosca para medir: Cuantificación de etanol. La muestra de la fermentación se congelaron hasta la medición de etanol, se centrifugaron a 3000 rpm/20 min a baja temperatura, el sobrenadante transferido a viales, para posteriormente medir concentración de etanol por cromatografía de gases Beckman Mod. GC 72-5, con detector de ionización de flama, nitrógeno como gas acarreador y columna de acero inoxidable de 6 pies de largo y 1/8 de pulgada de diámetro empacada con Porapak Q en análisis cromatográficos, se utilizaron las siguientes condiciones (10,13). Flujo de Nitrógeno 40 c.c./min., flujo de Hidrógeno 40 c.c./min., flujo de aire 230 c.c./min., temperatura de Columna 180 °C., temperatura de Inyector 170°C., temperatura de Detector 160°C., detector de ionización de flama, atenuación de Registro 0.8, velocidad de la Carta 0.1 pulg/min., volumen inyectado 1.0 microlitro.

Medición de crecimiento. Cada aislado se midio la turbidez (D.O.) a 600nm (2,4,5) en un espectrofotómetro Coleman Junior II, cada 24 h durante la fermentación.

Azúcares totales. La muestra utilizada para la cuantificación de etanol, también se emplearon para determinar azúcares totales en el medio de cultivo, por el método de la Antrona con una curva de calibración con estándares de glucosa (3).

Producción de etanol por Zymomonas

Resultados y discusión.

A partir de aguamiel de maguey, de caña de azúcar, de pulque, y de jugo de uva, se recuperaron 15 aislados de Zymomonas spp como se muestra en el cuadro 1, en donde se comprueba que este el género es cosmopolita y relativamente fácil de encontrar en la naturaleza, según se reporta en la literatura (1-4). En referencia a las pruebas bioquímicas de los aislados silvestres en comparación con la cepa de colección Z. mobilis ATCC 10988 de acuerdo con Bergey’s del 2000 (1), tuvieron morfología celular similar a la cepa de referencia: fueron diplobacilos Gram Negativos, móviles a excepción el aislado R4, mientras que los aislados silvestres respondieron negativamente a la síntesis de: oxidasa, la ureasa, la gelatinasa, el indol y la reducción nitratos, pero si liberaron catalasa y todos fermentaron la glucosa.

La cepa ATCC 10988 y el aislado denominado Zymomonas sp U I, fueron positivas al ácido sulfhídrico y la producción de gas de glucosa, a la fermentaron de fructosa y sacarosa con generación etanol, en donde la cepa ATCC 10988 creció mejor que los aislados en el medio de cultivo con diferente concentración de glucosa (11-14), aunque solo el aislado U I, genero etanol.

Los 15 aislados silvestres de Zymomonas fueron clasificados como Z. mobilis ya que fermentaron la glucosa a diferente concentración de 10, 30, 50, 100 y 150g/L, pero con una mínima liberación de etanol en comparación con la cepa Z. mobilis ATCC 10988 tanto en condición estática como en agitación a 100 rpm, mientras que la ATCC10988 con un nivel de glucosa de 10, 30, 50, 150g/L libero etanol hasta 104g/L de manera similar en agitación y como en condición estática, debido a lo anterior se selecciono a Z. mobilis U I aunque sintetiza levano (1) .

El cuadro 3 muestra el análisis comparativo del máximo rendimiento celular, entre la Z. mobilis silvestre UI de 0.17 en agitación a 0.15 estática en 10g/L de glucosa, mientras que para la ATCC 10988 fue de 0.36 y 0.69 en agitación con 10 y 150g/L de glucosa en el medio de cultivo (19-21).

Por otro lado se observo que la mayoría de los aislados silvestres producen levano, actualmente se analiza la capacidad que tienen y el potencial para su posible explotación.

Conclusiones

Los resultados de ambos cuadros 1 y 2 demuestran que si bien es posible recuperar Z.mobilis de jugos naturales la selección para la producción de etanol es un trabajo de tiempo, si se desea que esa capacidad sea natural, dado el contraste entre lo que libera la cepa de colección de la silvestre, pues con el avance de la ingeniería genética es posible seleccionar una Zymomonas spp mejor que la típica Saccharomyces spp, para la producción masiva de etanol que ayude a minimizar el impacto de la disminución combustibles del petróleo.

Cuadro 1. Origen de los aislados de Zymomonas mobilis productoras de levanoa etanolb y/o de algunas regiones de México.

*jugo o mosto en fermentación, **noreste, ***centro occidente, nororiente+++, +Costa noreste, ++centro de México.

Cuadro 2. Análisis comparativo de la producción de etanol por

Zymomonas mobilis** de colección y un aislado de jugos de frutos vegetales de algunas regiones de México.

**Condiciones de fermentación: Inóculo 5%, agitación 100 rpm

30°C, pH 5.0

Cuadro 3. Análisis comparativo del rendimiento de producción celular (Y=p/s) entre Zymomonas mobilis* de colección y un aislado silvestre de jugos naturales de vegetales de algunas regiones de México.

*condicione similares en agitación al cuadro 2.

Agradecimientos a Jeanneth Caicedo Rengifo por su trabajo secretarial,

al proyecto 2.7 de la CIC-UMSNH 2005-2006 por las facilidades para su publicación.

Literatura citada

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Gallegos, Morales Gabriel

Depto de Parasitología., Universidad Autónoma Agraria Antonio Navarro. Buena Vista, Coah, México.

Murillo Martínez Maria Elvira

Microbiología Industrial y del Suelo, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Nuevo León, San Nicolás de los Garza, N. L. México.

Sánchez-Yáñez Juan Manuel.

Microbiología Ambiental,

(autor correspondiente

Instituto de Investigaciones Químico Biológicas, Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Morelia, Mich, México