Introducción
Cuando culminé la Licenciatura en Microbiología en 1974, además de inexperiencia y deseos de descubrir especies bacterianas que salvaran la humanidad, sentía animadversión a los hongos, un mundo para el cual nunca me he sentido preparado. Como la vida se ensaña con nuestras debilidades, en más de una ocasión he tenido que sumergirme en temas donde esas curiosas formas solo nos admiten si jugamos sus reglas. Para esa partida, en los inicios, solo dispuse de tres armas: Métodos de Laboratorio en Microbiología (Harrigan y McCance, 1968); The OXOID Manual of Culture Media, Ingredients and other Laboratory Services (OXOID Limited, 1972) y el Atlas de Diagnóstico Micológico (Zapater, 1973).
En la actualidad existe abundante información sobre metodologías efectivas para el aislamiento y estudio de estos microorganismos a partir de casos clínicos y alimentos (Jarvis y Williams, 1987; King, 1992; Hocking y Pitt, 1992; Castañeda, 2001). Cuando se trata de aislarlos del suelo, u otros medios naturales, las añejas propuestas que les hago a continuación pueden resultar útiles; se trata de variantes implícitas en las fuentes mencionadas, en otras que pasaron fugazmente por mis manos y, sobre todo, a los golpes, reveses y modestos éxitos logrados en más de treinta años tras un microscopio y con la aguja o el asa en ristre.
Aislamiento de mohos y levaduras
a) Medios de cultivo
Existen muchos medios de cultivo que propician el crecimiento de los hongos. En general su pH oscila alrededor de 5,4. Este pH es muy adecuado una vez que se ha aislado el hongo, sin embargo, para los aislamientos primarios deben utilizarse medios de cultivo con un pH menor, sobre todo si se trata de muestras con presencia de bacterias; un pH de 3,5 resulta adecuado a tal fin. Deben preferirse aquellos medios que propicien el crecimiento de la mayoría de los hongos (Jarvis y Williams, 1987; Pit. 1992; Pit et al., 1992; Skaar y Sterwing, 1996)
b) Las muestras
El material blando se agita de forma continua, durante 2 minutos, o más, en un matraz con perlas de vidrio, o en una licuadora durante 30 segundos, o en un homogeneizador peristáltico durante 1 minuto, empleando como diluyente una solución de peptona al 0,1% p/v (King, 1992) a la que se puede añadir 0,05 % de tween 80 p/v (Jarvis y Williams, 1987). El material duro se muele en un molinillo de granos. También se puede emplear en algunos casos solución fisiológica, solución reguladora de fosfatos o agua destilada con o sin humectante (Hocking y Pitt, 1992).
En los productos secos, o jugos concentrados, debe evitarse el choque osmótico. A ese fin, se diluyen con una solución de sacarosa o glucosa al 20% p/v. Si se trata de productos salados se emplea un diluyente con 5% p/v de NaCl. Cuando la muestra tiene gran cantidad de azúcares y es muy ácida, debe diluirse (1+1) con solución de peptona al 0,1% p/v y ajustar el pH a 3,5 – 4,0 (Jarvis y Williams, 1987).
Cuando el interés radica en aislar mohos, el pH de los medios comerciales (5,4 o mayores) se puede reducir adicionando ácido tartárico al 10% (1 mL por cada 100 mL de medio de cultivo ya estéril y a 50 ºC). Los medios no deben calentarse luego de esta acidificación pues provocaría la hidrólisis del agar y, con ello, la pérdida de sus propiedades gelificantes.
Si en los aislamientos de mohos se desea inhibir el crecimiento de bacterias esto se logra incorporando al medio de cultivo Rosa de Bengala, Rosa de Bengala-Dicloran (0,035 – 0,067 g/L), entre otros, o antibióticos como Penicilina (50 UI/mL) y Estreptomicina (100 UI/mL).
Los medios con Rosa de Bengala y Rosa de Bengala-Dicloran es preciso guardarlos en la oscuridad para evitar la formación de un compuesto inhibidor por degradación fotoquímica del colorante. Las soluciones de Dicloran (2,6 Dicloro 4-Nitroanilina) (Jarvis y Williams, 1987) y Rosa de Bengala no es necesario esterilizarlas y se conservan bien en refrigeración.
Un antibiótico muy útil es el Cloranfenicol, como es termoestable, se puede añadir al medio antes de esterilizar. Otras variantes termosensibles se agregan asépticamente al medio estéril fundido, tal es el caso de la Clortetraciclina (10 mL de solución acuosa al 1% p/v en 1 L de medio).
Una vez efectuada la siembra, los medios se incuban a 25 ºC durante 5 días (Pitt et al., 1997). Aunque tales condiciones de incubación son las sugeridas en la generalidad de los textos, de acuerdo al área geográfica resultan de utilidad las recomendaciones de Jarvis y Williams (1987) al respecto de colocar las placas dentro de una bolsa plástica acompañada de un recipiente con agua para evitar la desecación, durante 3 a 7 días a 25 °C en las regiones subtropicales; a 30 °C en las tropicales, y a 22 °C en las templadas.
Si se desea favorecer el aislamiento de levaduras se debe alcanzar el pH óptimo mediante adición de ácido clorhídrico o ácido fosfórico, no con ácidos orgánicos pues muchos inhiben el crecimiento de las levaduras. Se procede de igual forma a como se explicó para los mohos.
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