DETERMINACIÓN ENZIMÁTICA DE SACAROSA

Indice1. Estructura y función 2. Un poco de historia… 3. Análisis de disacáridos 4. Métodos espectrofotométricos 5. Métodos no enzimáticos 6. Métodos enzimáticos 7. Bibliografía

1. Estructura y función

La sacarosa (azúcar de mesa) es un disacárido de glucosa y fructosa. Se sintetiza en plantas pero no en animales superiores. No contiene ningún átomo de carbono anomérico libre, puesto que los carbonos anoméricos de sus dos unidades monosacáridos constituyentes se hallan unidos entre sí covalentemente mediante un enlace O-glucosídico. Por esta razón, la sacarosa no es un azúcar reductor y tampoco posee un extremo reductor. Su nombre abreviado puede escribirse como Glc(a -1à 2)Fru o como Fru(b 2à 1)Glc. La sacarosa es un producto intermedio principal de la fotosíntesis, en muchas plantas constituye la forma principal de transporte de azúcar desde las hojas a otras partes de la planta. En las semillas germinadas de plantas, las grasas y proteínas almacenadas se convierten en sacarosa para su transporte a partir de la planta en desarrollo.

Los disacáridos no pueden entrar directamente en la ruta glucolítica, desde luego no pueden entrar en las células sin haber sido previamente hidrolizados a monosacáridos extracelularmente. En los vertebrados, los disacáridos ingeridos se han de hidrolizar primero por enzimas unidos a la superficie externa de las células epiteliales que cubren el intestino delgado para dar sus unidades monosacáridas. Los monosacáridos así formados se transportan al interior de las células que tapizan el intestino, desde las que pasan a la sangre siendo transportados a hígado. Allí son fosforilados y canalizados hacia la secuencia glucolítica. La mayor parte de las triosas fosfato generadas por fijación del CO2 en las plantas se convierte en sacarosa o almidón. La sacarosa puede haber sido seleccionada durante la evolución como forma de transporte del carbono debido a que su unión poco usual, que une el C-1 anomérico de la glucosa al C-2 anomérico de la fructosa, no es hidrolizada por amilasas u otras enzimas que escinden glúcidos comunes. La sacarosa se sintetiza en el citosol, empezando con la dihidroxiacetona fosfato y gliceraldehído – 3 – fosfato exportadas del cloroplasto. Después de la condensación a fructosa-1,6-bisfosfato (por la aldolasa), la hidrólisis por la fructosa-1,6-bisfosfatasa forma fructosa-6-fosfato. La sacarosa-6-fosfato sintasa cataliza la reacción de la fructosa-6-fosfato con UDP-glucosa (glucosa activada) para formar sacarosa-6-fosfato. Finalmente, la sacarosa-6-fosfato fosfatasa elimina el grupo fosfato haciendo que la sacarosa esté disponible para su exportación desde la célula a otros tejidos. La comunicación y coordinación entre síntesis de sacarosa en el citosol y fijación de carbono y síntesis de almidón en el cloroplasto están mediadas por el sistema de cotransporte antiparalelo Pi-triosas fosfato. Si la síntesis de sacarosa es demasiado rápida, el transporte del exceso de Pi al cloroplasto dará lugar a la eliminación de demasiada triosa fosfato, esto tiene un efecto deletéreo sobre la velocidad de fijación de carbono porque se sintetizan cinco de cada seis moléculas de triosa fosfato producidas en el ciclo de Calvin para regenerar la ribulosa-1,5-bisfosfato y completar el ciclo. Si la síntesis de sacarosa es demasiado lenta, habrá una insuficiencia de Pi en el cloroplasto para la síntesis de triosa fosfato. La síntesis de sacarosa está regulada principalmente en tres pasos, los catalizados por la fructosa-1,6-bisfosfatasa, sacarosa-6-fosfato sintasa y sacarosa fosfato fosfatasa. Cuando la luz incide por primera vez sobre la hoja por la mañana, aumentan los niveles de triosa fosfato en el citosol (provenientes de la fijación de carbono en el cloroplasto). Las triosas fosfato inhiben la actividad de la fosfofructoquinasa-2 disminuyendo los niveles de fructosa-2,6-bisfosfato. Esto libera la inhibición de la fructosa-1,6-bisfosfatasa, lo que permite la síntesis de fructosa-6-fosfato y así de otras hexosas fosfato, incluida la glucosa-6-fosfato. La glucosa-6-fosfato es un activador alostérico de la sacarosa-6-fosfato sintasa. La sacarosa fosfato fosfatasa cataliza el paso final en la síntesis de sacarosa a medida que dispone de sustrato.

2. Un poco de historia…

La historia de la investigación de disacáridos está íntimamente ligada al desarrollo de la bioquímica. El esfuerzo por entender la estructura de los azúcares, el proceso de fermentación, la naturaleza de los enzimas, la catálisis biológica, y la ruta del carbono asimilado durante la fotosíntesis y el seguimiento del curso de las rutas metabólicas, a menudo involucran el estudio de disacáridos, especialmente la sacarosa. La forma de preparar azúcar de caña cristalina pura (sacarosa) se conocía desde los tiempos antiguos, pero su naturaleza química era un misterio hasta mediados del siglo XIX. Este fue el caso también del disacárido lactosa, el cual fue aislado por primera vez por Bartoletti en 1619. Fue Sigismud Andreas Marggraf quien entre 1747 y 1762 logró aislar azúcar cristalina a partir de remolacha y otras plantas por extracción en una solución etanólica caliente en presencia de cal. Él afirmó, basándose en el sabor, forma de los cristales y "estabilidad" en soluciones alcalinas que el material obtenido de esas fuentes era el mismo que el obtenido de la caña de azúcar. Se necesitó un período adicional de doscientos años de investigación para finalmente establecer la naturaleza química de este compuesto y para entender como es sintetizado en la naturaleza. Dos de las técnicas que empleó Marggraf, extracción con alcohol caliente y el uso de una solución alcalina en la cual la sacarosa es estable, siguen siendo métodos prácticos fundamentales usados para la extracción, purificación y análisis de sacarosa. Entre 1810 y 1830, se estableció la composición química del azúcar, por GayLussac, Berzelius y Dumas. Dumas en 1828, Presoz en 1833, Peligot en 1838 y Biot en 1842, concluyeron que la sacarosa puede ser dividida por ácido o por un "fermento" derivado de la levadura u otras fuentes biológicas, produciendo un azúcar "reductor". Fue Dubrunfaut quien en 1847 finalmente estableció que esta reacción provee glucosa y una cetosa, la cual mostraba ser fructosa. La invertasa de levadura fue identificada como una entidad catalítica individual por Berthelot en 1860. Estudios posteriores de O´Sullivan, E. Fisher y Armstrong hacia finales del siglo XIX, y por C.S. Hudson entre 1908 y 1915, transformaron a la invertasa en un agente comúnmente usado en el análisis de sacarosa y azúcares en general. En la segunda mitad del siglo XIX se aislaron y caracterizaron otros disacáridos, y junto con la identificación química de estos compuestos, se obtuvieron los enzimas que causan su hidrólisis. Aunque los científicos de esa época percibieron el potencial que tenían estos enzimas para el análisis específico de disacáridos, sus esfuerzos en esta dirección se vieron frustrados porque las preparaciones de enzimas usadas en esa época eran impuras, conteniendo más de una actividad hidrolasa. A principios del siglo XIX, el análisis de soluciones de sacarosa se basaba en la determinación de la gravedad específica, una técnica que está todavía en uso en la industria azucarera, la cual es útil para la determinación de soluciones de azúcar en el rango 0.1-99%. En 1842, Biot y Ventzke descubrieron las propiedades ópticas de los azúcares, y la "inversión" de la rotación óptica que ocurre cuando la sacarosa es hidrolizada por ácidos. Esto inmediatamente llevó al desarrollo de métodos polarimétricos para la determinación de azúcares en solución, usando polarímetros. En 1831, Becquerel se encontró con que unos azúcares pueden reducir cobre alcalino, y Barreswill (1846) usó esta reacción para la cuantificación de azúcares en solución. H. Fehiling en 1849 mejoró el procedimiento y estableció la permanencia de uno de los reactivos más importantes disponibles para el análisis de azúcares. El método de Fehiling permite la determinación de azúcares en solución del orden de 2-300mg. Hacia finales del siglo XIX, se desarrollaron reacciones adicionales para el análisis de azúcares basadas principalmente en la reactividad del carbono carbonílico, como por ejemplo, oxidaciones, aminaciones, formación de hidrazonas, entre otros. Se desarrollaron tests colorimétricos cualitativos específicos para azúcares, tales como reacciones con variados compuestos fenólicos en medio ácido. Al comienzo del siglo XIX, estas reacciones colorimétricas, como también los clásicos métodos redox, se convirtieron en ensayos espectrofotométricos cuantitativos, y la sensibilidad de la determinación de azúcares aumentó a un nivel de 0.1-1m mol por muestra. Entre 1928 y 1938, reactivos bioquímicos clave como ATP, NAD+ y NADP+, hexoquinasa, fosfoglucoisomerasa y mutasa, y la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa fueron descubiertos por Meyerhof, Lohman, Von Euler, Warbug y Cori entre otros. El uso de estos enzimas en un procedimiento espectrofotométrico para el análisis de glucosa al nivel de mmol surgió como un bonus de estos estudios bioquímicos. La introducción de la cromatografía, el uso de radioisótopos, y el desarrollo de las técnicas espectroscópicas en el período 1940-1950 abrieron puertas para la determinación de azúcares en estudios biológicos. El desarrollo y la sofisticación de técnicas e instrumentación nos traen donde nos encontramos ahora, que podemos estudiar y analizar azúcares de forma rápida, precisa y en los niveles de sensibilidad del orden de pmol. Con respecto a la estructura de la sacarosa, el análisis de metilación de Irvine y Haworth, entre 1903 y 1927, y los estudios polarimétricos de Hudson en el mismo período, proporcionaron el modelo estructural del disacárido tal como lo conocemos hoy. La espectroscopia NMR en 1960 determinó la conformación espacial exacta de la molécula. En 1953, Lemieux y Huber sintetizaron químicamente la sacarosa por primera vez. La síntesis enzimática de sacarosa utilizando sacarosa fosforilasa bacteriana fue lograda por Hassid, Doudoroff y Barker en 1944, y la síntesis por sacarosa sintasa de plantas fue lograda por Leloir y Cardini en 1955.

3. Análisis de disacáridos

Estrategia Antes de aplicar un procedimiento analítico específico es necesario tener una buena idea de cuales carbohidratos están presentes y los rangos de concentración de las soluciones estudiadas. Si el sistema es completamente desconocido, una evaluación cualitativa por TLC y un análisis de los azúcares totales presentes deben ser obtenidos primero. La elección de la metodología cuantitativa específica va a depender de muchos factores:

1. El objetivo del análisis.
2. El rango de concentración del disacárido.
3. La presencia de otros carbohidratos u otros compuestos que puedan interferir con el método particular para el disacárido de interés.
4. El grado de precisión requerido.
5. El disacárido no debe ser degradado antes ni durante el análisis dado que se podrían obtener datos erróneos.
6. La disponibilidad del reactivo analítico específico, su costo y eficacia.
7. La accesibilidad a la instrumentación específica necesaria.

Cabe notar que para muchos fines, una técnica simple y barata para el análisis de carbohidratos puede lograr excelentes resultados- casi tan buenos como los obtenidos con técnicas e instrumentos sofisticados y caros. Recordar que la caracterización de un disacárido por una técnica dada, debe ser siempre verificada por un segundo método independiente.

4. Métodos espectrofotométricos

El término espectrofotometría se refiere al uso de la luz para medir las concentraciones de sustancias químicas. Cuando una molécula absorbe un fotón, su energía se incrementa. Se dice que pasa a un estado excitado. Si por el contrario emite un fotón, su energía disminuye. El estado de menor energía de una molécula se denomina estado basal o fundamental. En la siguiente figura se describe un esquema básico de un espectrofotómetro: Monocromador – Celda con el analito – Detector de luz Fuente de luz – (Selección de longitud de onda) Una fuente de luz se hace pasar por un monocromador. Éste permite seleccionar un haz de luz con una única longitud de onda. Este haz de luz monocromática incide sobre una celda de ancho b que contiene la solución con el analito. Si la solución absorbe la luz, la potencia radiante incidente (Po) (1) del haz de luz disminuye al emerger de la celda. Los valores de la potencia radiante emergente (P) tienen que cumplir necesariamente la siguiente relación: P £ Po(1) La potencia radiante se define como energía por unidad de tiempo y por unidad de área o sección.

– Magnitudes en Espectrofotometría La transmitancia se define de la siguiente forma:

En tanto, la absorbancia se define como:

Cuando no se absorbe luz, P = Po y por lo tanto A = 0. Cuando se absorbe 90 % del haz de luz, 10 % de éste se transmite, por lo que P = Po / 10 y A = 1.

– Ley de Beer

Donde:

• A es la absorbancia (magnitud adimensional)
• e es un coeficiente de proporcionalidad denominado absortividad molar. Indica la absorbancia de una determinada sustancia a una longitud de onda dada y se expresa en M-1. cm-1.
• b es el ancho o espesor de la celda donde se deposita la muestra y se expresa en cm.
• c es la concentración expresada en moles / Litro (M)

La ley de Beer establece que la absorbancia es proporcional a la concentración de las especies absorbentes. Dicha ley se verifica muy bien en un rango definido de concentraciones (£ 0.01 M). Las fallas aparentes de la ley de Beer en soluciones más concentradas pueden atribuirse a cambios en las propiedades de las especies absorbentes de la solución. Conforme una solución se vuelve más concentrada, las moléculas de soluto interactúan entre sí debido a su proximidad, modificando sus propiedades de absorber la luz. De ello resulta que la gráfica de Absorbancia en función de la concentración pierde su linealidad.

5. Métodos no enzimáticos

1. Este es probablemente el procedimiento más común para la estimación del contenido total de azúcares reductores y glucósidos. Una muestra de 0.01 – 0.25 m mol de azúcar en 0.3 mL se mezcla con 0.01mL de fenol 10%. Se agrega 1.0mL de H2SO4 concentrado de grado analítico a la mezcla azúcar – fenol. Después de mezclar, se incuba por 30 minutos a temperatura ambiente. Luego se mide la absorbancia a 490nm. Algunas sustancias tales como cationes de metales pesados, compuestos azo- y tio- podrían interferir.

2. Fenol – H2SO4
3. Antrona – H2SO4

El medio ácido hidroliza el enlace glicosídico de la sacarosa y los monosacáridos resultantes reaccionan con la antrona produciendo un color verde – azulado. Para el análisis de sacarosa, una muestra de 100m L (0.05-0.4m mol de sacarosa) se mezcla con 100m L de NaOH 30%, y se calienta por 10 minutos a 100°C. Se deja enfriar a temperatura ambiente y se agregan 3.0mL del reactivo de antrona (0.15% en 80% H2SO4). Después de 15 minutos a 40°C, se mide la absorbancia a 620nm.

Antrona

6. Métodos enzimáticos

1. Introducción

Desde un punto de vista analítico, la capacidad de los enzimas para catalizar reacciones específicas con un alto grado de eficacia, ha dado lugar a diferentes aplicaciones en diversos campos del análisis como análisis clínicos, análisis de productos alimentarios, análisis de preparados farmacéuticos etc. El análisis enzimático o análisis mediante el empleo de enzimas puede ser utilizado en: 1. La determinación de los sustratos de la reacción enzimática, siendo posible determinar específicamente cada una de las sustancias de una mezcla sin necesidad de separar. Para la cuantificación de sustratos se pueden utilizar dos métodos generales: a. Métodos de cambio total, de equilibrio o de punto final. En este tipo de métodos (los más utilizados en la práctica) se permite que la reacción enzimática se complete o llegue al equilibrio y se mide la variación producida en la concentración de un producto de reacción o de un reactivo presente inicialmente en exceso. b. Métodos cinéticos, en los que se utilizan medidas de la velocidad inicial de la reacción enzimática para deducir la concentración inicial de sustrato. Los procedimientos de medida son idénticos a los utilizados para reacciones catalíticas en general. 2. Determinación de los mismos enzimas mediante el empleo de métodos cinéticos en los que se mide la velocidad de desaparición del sustrato o de generación del producto, relacionada con la concentración de enzima en disolución.

1. Determinación de otras sustancias mediante el empleo de reactivos marcados con enzimas: enzimoinmunoanálisis.

El objetivo de esta práctica es determinar el contenido de sacarosa en un preparado empleando para ello un método enzimático espectrofotométrico de tiempo fijo.

2. Fundamentos Aunque la glucosa puede determinarse por métodos químicos, estos en su mayoría carecen de especificidad y no pueden distinguir la glucosa de otros monosacáridos. Tanto en análisis clínicos como en la industria alimentaria y farmacéutica se utilizan métodos enzimáticos para la determinación de glucosa. La glucosa oxidasa es una flavoproteína altamente específica que cataliza la oxidación de la glucosa a b -D-gluconolactona, sin que ningún otro azúcar natural reaccione en extensión apreciable. C6H12O6 + O2 C6H10O6 + H2O2Esta reacción en la que se consume oxígeno podría seguirse manométricamente o mediante un electrodo de oxígeno. Sin embargo, para poder seguir el curso de esta reacción espectrofotométricamente es necesario acoplar a la misma una segunda reacción enzimática indicadora adecuada. Así, para la determinación colorimétrica de glucosa por el método de la oxidasa, se añade al medio peroxidasa de rábano silvestre (HRP), que elimina el peróxido de hidrógeno a medida que se forma, a la vez que se genera un colorante adecuado según el siguiente esquema de reacción: H2O2 + Aceptor de oxígeno Producto coloreado + H2O (DH2) (D) Se podrían utilizar como aceptores de oxígeno benzidina, o-toluidina, o-dianisidina. Sin embargo, la naturaleza carcinogénica de estos compuestos ha impulsado la búsqueda de aceptores alternativos. Uno de estos sistemas es la 4-aminoantipirina, que reacciona con el p-hidroxibencensulfonato y el peróxido de hidrógeno en presencia de HRP para formar un colorante quinonaimina con un máximo de absorción a 505 nm, de acuerdo al siguiente esquema de reacción.

Este método, propuesto por Trinder (1) en 1972, será el empleado en esta práctica para la determinación de glucosa en un preparado. A continuación se resumen las distintas reacciones acopladas que se utilizarán para la determinación de la glucosa. La cantidad de colorante generada, y por tanto la absorbancia medida a 505 nm, será directamente proporcional a la cantidad de glucosa. El disacárido sacarosa puede también determinarse específicamente basándose en el esquema de reacciones anterior, previa hidrólisis enzimática del mismo con el enzima fructofuranosidasa o invertasa. Este enzima cataliza la transformación de la sacarosa en una molécula de fructosa y una molécula de glucosa (azúcar invertido).

3. Material, reactivos, instrumentación a. Instrumentación

– Espectrofotómetro con cubetas de 1 cm de paso de luz. b. Material

• 4 matraces de 100 ml
• 8 matraces de 25 ml
• 1 vaso de 250 ml, 2 vasos de 100 ml
• 1 embudo, papel de filtro, vidrio de reloj.

c. Reactivos

• Reactivo Trinder: Disolución que contiene todos los reactivos necesarios para la determinación de la glucosa por el método propuesto en las concentraciones que se indican a continuación:
• • 4-aminoantipirina 0,5 mmol/L
  • p-hidroxibencensulfonato 20 mmol/L
  • Glucosa oxidasa (GOD) obtenida de Aspergillus Niger 15 U/mL
  • Peroxidasa de rábano silvestre (Horseradish peroxidase, HRP) 10 U/mL

Pesar las cantidades adecuadas de los reactivos indicados y disolver en una disolución reguladora de Tris 0,02 M de pH 7,0. Llevar a volumen en un matraz de 100 mL. Esta disolución debe almacenarse en botellas color topacio y en el refrigerador.

• Disolución de invertasa 72 U/ml en tampón de citrato 0,1 M de pH 4,6. Preparar 25 mL
• Disolución patrón de glucosa 0,01 M

Procedimiento Se empleará un método de tiempo fijo para la cuantificación de sacarosa en una muestra de un preparado. Para la construcción de la línea de calibrado deben prepararse cinco disoluciones de glucosa de concentraciones comprendidas entre 5´ 10-5 M y 5´ 10-4 M por dilución del patrón de glucosa. Añadir a la cubeta del espectrofotómetro 1 mL de reactivo Trinder y 250 µL de patrón, mezclar e incubar exactamente 18 minutos a temperatura ambiente. Medir a continuación la absorbancia de la mezcla de reacción a 505 nm frente a un blanco de reactivos. Para la determinación de glucosa y sacarosa en la muestra, esta se disolverá y/o diluirá con agua en la proporción adecuada según el contenido de glucosa y sacarosa esperado. Para determinar el contenido de sacarosa se llevará a cabo en primer lugar su hidrólisis enzimática a glucosa y fructosa (inversión) con invertasa. Para ello se toman 2 mL de la disolución de muestra y se mezclan con 8 mL de la disolución de invertasa. Se incuban 15 minutos a 55 ºC. La suspensión fría se filtra, se lava el filtro y se recoge cuantitativamente en un matraz aforado enrasando con agua hasta la marca.realizando a continuación la determinación del contenido total de glucosa según el procedimiento anteriormente descrito. El contenido de sacarosa se obtiene por diferencia entre las concentraciones de glucosa obtenidas antes y después de la inversión enzimática. Expresar el contenido de glucosa y sacarosa en la muestra en g/g de muestra.

7. Bibliografía

1. D. Barham, P. Trinder; Analyst,1972, 97, 142-145
2. P.M. Dey, J.B. Harborne; Methods In Plant Biochemistry. Vol. 2.
3. L. Stryer; Bioquímica. 4ta. Edición.
4. A. Lehninger; Principios de bioquímica. 2da. Edición.
5. L.G. Wade, Jr.; Química Orgánica. 2da. Edición.
6. F.A. Carey; Química Orgánica. 3ra. Edición.
7. Tinoco, Jr.; Physical Chemistry. 3ra. Edición.
8. Internet: www.chemfinder.com

www.chemweb.com

www.spectragalactic.com

www.probes.com/handbook

www.netbiochem.com

Autor:

Marcie Jiménez Riani